单细胞转录组学揭示胰腺腺鳞癌异质性进展和EGFR激活
发布时间：2021-08-24 15:55:12
近日，首都医科大学附属北京朝阳医院赵昕老师团队采用新格元单细胞测序技术，在《International Journal of Biological Sciences》上发表胰腺腺鳞癌的单细胞转录组测序文章，题为：Single-cell transcriptomics reveals heterogeneous progression and EGFR activation in pancreatic adenosquamous carcinoma。文章采用3例人胰腺组织，利用新格元自主研发的GEXSCOPE®组织保存试剂，微流控微孔板芯片以及可定制化的个性化生信分析服务，成功获得了高质量的单细胞测序数据，助力人类胰腺时空景观的构建。
研 究 背 景
胰腺癌(Pancreatic cancer,PC)是人类最致命的胃肠道癌症，5年生存率仅为7%。胰腺腺磷癌(Pancreatic adenosquamous carcinoma,PASC)是一种组织学上包括腺癌和鳞状细胞癌的混合性胰腺恶性肿瘤，占PC的1-4.4%，同时PASC具有高度侵袭性，预后较差，两年的生存率为13%。由于PASC发病率低，其肿瘤发生、进展及分子特征尚不清楚，目前尚无针对PASC的分子靶向治疗。
方 法 流 程
文章对1例导管内乳头状黏液性肿瘤患者(Intraductal papillary mucinous neoplasm,IPMN)，1例胰腺腺磷癌患者和1例正常组的胰腺组织中9887个细胞进行单细胞RNA测序(scRNA-seq)，分析胰腺腺磷癌的异质性。
研 究 结 果
scRNA-seq图谱确定了正常胰腺、IPMN和PASC中的细胞类型
文章根据scRNA-seq结果，确定了10个细胞类型，包括导管细胞、癌细胞、免疫细胞等。同时文章发现S100A2、PLVAP和CTRB2分别是PASC、内皮细胞和腺泡细胞的新标记物。
图一 3例胰腺样本细胞图谱绘制
文章应用公共数据库来揭示PASC细胞基因标记物S100A2的临床意义。结果表明，S100A2不仅在PC组织中高表达，还与不良预后相关。在人类蛋白图谱中，S100A2蛋白也在PDAC肿瘤中过表达，但在正常胰腺中未检测到，这都揭示了S100A2与PASC较差的临床特征有关。
图二 S100A2与PC的恶性临床特征相关
PASC细胞DEGs和富集分析
为了阐明PASC进展过程中的异常细胞功能，文章比较了2350个基因在癌症和导管细胞之间的表达，鉴定差异基因表达(DEGs)。GO分析显示，该基因集与靶向于膜的共翻译蛋白的激活和RNA生物合成的正调控失活显著相关。
图三 胰腺导管和PASC细胞的DEGs和富集分析
拟时序分析揭示导管细胞和PASC细胞的分化关系
文章基于5个导管细胞和4个癌细胞亚群的scRNA-seq数据进行拟时序分析，揭示了这些细胞中具有不同基因型的三种进化动态状态。总的来说，癌细胞的形成是在正常导管细胞进化之后才出现的，四种癌细胞亚群沿着两种分化轨迹进化，而导管细胞则遵循一种进化状态。
图四 导管细胞和PASC细胞的发育轨迹
癌细胞亚群的鉴定
文章根据KRT19、KRT7、EPCAM、SOX9和KRT23等上皮细胞和癌症标记物，鉴定了559个癌细胞，并将其分为五组(C1-C5)，与其他亚群相比，UBE2C、ASPM、CENPF和TOP2A在C1中显著过表达，同时观察到C2表达MXD1、ELF3和LMO7。文章在C3中发现了LAMA3、LAMC2、LAMB3、MMP1和SERPINE1的过表达，表明这种细胞类型参与了微环境重建。出乎意料的是，C4没有表达特定的分子标记。由于病理肿瘤组织为腺鳞癌，在C5中观察到多种角蛋白，包括KRT1、KRT6B、KRTDAP和KRT10。
图五 癌细胞亚型
EREG、FCGR2A、CCL4L2、CTSC在PASC髓系细胞中过表达
由于大多数间质细胞是髓系细胞，文章还研究了这些细胞类型的基因变异，以预测其对PASC发育的影响。髓系细胞分为5个亚群：巨噬细胞、树突状细胞、增殖巨噬细胞、肥大细胞和浆细胞样树突状细胞。研究发现，IPMN和PASC上调EREG、FCGR2A、CCL4L2、CTSC这四个基因，这些髓系细胞的异常变化，表明阻断髓系细胞的发展可以抑制PASC的肿瘤发生。
图六 正常胰腺、IPMN和PASC的髓系细胞基因上调
肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)恢复免疫抑制肿瘤微环境
为了描述肿瘤微环境中成纤维细胞的异质性，文章将1135个细胞分为纤维细胞、肌成纤维细胞和CAFs。文章对成纤维细胞和CAFs进行差异表达分析，以揭示CAFs的异常功能。GSEA结果显示，富集的DEGs与B细胞激活和免疫应答呈负相关，与骨发育和创面愈合呈正相关。在分子功能方面，该基因集参与了“细胞骨架结构组成”、“钙离子结合”和“细胞外基质结构组成”，参与了细胞外和细胞内微环境的重构。同时25个DEGs与肌动蛋白细胞骨架的加速有关，肌动蛋白在细胞迁移中起着重要作用。因此，我们发现CAFs可能通过重建免疫抑制微环境促进肿瘤进展。
图七 肿瘤相关成纤维细胞在PASC中的功能
成纤维细胞、髓系细胞和PASC细胞中EGFR相关配体受体对的激活
为了检测PASC进展过程中的细胞间相互作用，我们基于scRNA-seq数据和CellPhoneDB数据库进行了细胞间通信分析。结果显示，与其他类型的细胞相比，PASC细胞与髓系细胞和成纤维细胞的交流更密切。文章又进一步筛选了导管细胞与这两种基质细胞类型之间激活的配体受体对，并定义了若干癌症相关的配体受体对，如EGFR/TGFB1、ANXA1/FPR3、EREG/EGFR、ICAM1/AREG。成纤维细胞、髓系细胞和癌细胞之间的相互作用可能为PASC提供一个潜在的治疗靶点。
图八 间质细胞和PASC细胞之间的细胞通讯
研 究 结 论
本文使用单细胞RNA测序分析了1例IPMN患者，1例PASC患者和1例正常的胰腺组织，通过无监督聚类分析确定了不同的细胞亚群，同时进行了DEGs和富集分析。文章从单细胞角度研究了PASC进展过程中导管细胞和基质细胞的变化，发现了新的肿瘤细胞分子标记，定义了潜在的癌症相关信号通路，并破译了PASC肿瘤发生过程中的细胞间通讯。综上所述，这些结果为理解PASC的关键生物学过程提供了有价值的信息，并展示了PASC的潜在治疗靶点。
