项目文章||单细胞测序揭示乙肝病毒相关慢加急性肝衰竭中肝淋巴内皮细胞的状态
发布时间：2022-06-03 13:19:25
近日，中南大学湘雅第三医院移植中心在国际著名杂志Journal of Clinical Medicine发表了题目为“Single-Cell RNA Transcriptomics Reveals the State of Hepatic Lymphatic Endothelial Cells in Hepatitis B Virus-Related Acute-on-Chronic Liver Failure”的研究成果，该研究基于单细胞转录组测序技术，利用人肝脏样本，探讨了肝淋巴管(LVs)和淋巴管内皮细胞(LyECs)在慢加急性肝衰竭(ACLF)中的作用。与肝硬化患者相比，ACLF患者肝内LVs明显减少，且肝脏有大量单核/巨噬细胞浸润，ACLF表现出比肝硬化更严重的肝损伤和炎症。其中单细胞转录组测序部分由新格元团队提供支持。
研究背景
慢加急性肝衰竭是一种急性综合征，由肝炎、酗酒等行为引起的慢性肝病加重，如肝硬化等。异体肝移植是对ACLF患者最有效的治疗方法，然而，异体肝移植的费用和肝来源限制，使许多患者无法及时接受治疗。迫切需要新的、有效的方法来降低ACLF的发病率和死亡率。
先天免疫系统在ACLF的进展中起着重要的促进作用。活化的Kupffer细胞(KCs)分泌促炎细胞因子，放大促炎信号，进一步促进炎症过程。在各种免疫细胞中，巨噬细胞与LVs互作最多。LyECs分泌趋化因子来吸引巨噬细胞。同时巨噬细胞分泌淋巴管生成细胞因子以促进炎症诱导的淋巴管生成。深入探索肝内LVs与浸润性巨噬细胞之间的关系，可以为ACLF临床治疗提供坚实的理论基础。
本篇研究中，作者使用scRNA-seq来探索HBV相关肝硬化和ACLF之间LyECs状态功能的变化。探讨ACLF的病理生理机制，并寻找新的降低ACLF的发病率和死亡率的干预措施。
研究结果
1）ACLF比肝硬化患者表现出更严重的肝损伤和炎症
研究者对肝硬化患者和ACLF患者血浆中的ALT、AST、TBil和INR进行了检测，ACLF患者中ALT、AST、TBil、INR水平显著升高。健康对照（HC）、肝硬化患者和ACLF患者的H&E染色显示，ACLF患者的肝实质坏死和炎症细胞浸润面积大于健康对照和肝硬化患者。根据qRT-PCR结果，ACLF患者的促炎细胞因子水平极高，提示ACLF患者肝脏存在高炎症状态。Masson染色显示，与HC相比，肝硬化患者和ACLF患者的胶原沉积明显，这意味着ACLF是从肝硬化发展而来的。
图1 ACLF患者比肝硬化患者表现出更严重的肝损伤和炎症
2）单细胞转录组测序显示ACLF患者有更多单核/巨噬细胞浸润
为了进一步分析三组患者的肝内炎症环境，作者对2例HC、3例肝硬化患者和5例ACLF患者的肝组织中分离出来的非实质细胞进行了scRNA-seq。共纳入26,200个细胞，重新聚类定义了20个亚群；进一步对这些细胞群进行注释，获得11种细胞类型。来自HC、肝硬化和ACLF组的细胞，组间分布存在显著差异。作者发现ACLF患者肝脏中的单核/巨噬细胞在体外共表达CD14和CD68。与肝硬化组相比，ACLF组的单核/巨噬细胞数量明显升高，并进行了IHC染色验证。
图2 单细胞测序显示大量的单核/巨噬细胞浸润到ACLF肝脏
3）单细胞测序揭示了ACLF患者肝淋巴细胞凋亡和功能障碍
为了探讨三组样本中肝内LyECs的功能和状态，作者进一步分析了内皮细胞和上皮细胞的亚群，获得7个细胞簇，包括5个内皮亚群，1个上皮亚群，以及1个肝细胞亚群，通过聚类热图的形式展示了每个亚群基因表达特征。LyEC1和LyEC2基因簇具有相似的图谱，但部分基因表达丰度存在明显差异，这表明它们处于不同的状态。比较不同样本中细胞组成分布，发现LyEC2簇几乎只存在于ACLF患者的肝脏中，显示了ACLF中肝脏LyECs的功能改变。
利用GO功能富集分析，作者发现LyEC2簇主要参与了凋亡过程。此外，ACLF组LyECs中的典型功能基因PROX1的表达水平显著下降。以上证据提示，ACLF患者肝脏中LyECs可能发生细胞凋亡和功能障碍。
图3 单细胞测序显示ACLF患者肝脏中LyECs的凋亡和功能障碍
4）ACLF患者肝脏浸润单核/巨噬细胞分泌SPP1诱导LyECs凋亡及功能障碍
ACLF患者的炎症程度，以及单核/巨噬细胞浸润明显高于HC和肝硬化患者。作者假设ACLF患者浸润单核/巨噬细胞参与了LyECs功能障碍。对单核/巨噬细胞亚群的进一步分析显示了7个不同的簇。ACLF组中M1和M4聚类的比例显著增加。通过细胞间配体/受体分析，鉴定了单核/巨噬细胞和LyECs之间的潜在调控网络，发现LyEC2簇是单核/巨噬细胞和LyECs之间相互作用网络的核心。进一步分析显示，单核/巨噬细胞主要通过SPP1/ITGB1通路调控LyEC2簇，而SPP1在ACLF肝脏中主要由单核/巨噬细胞产生。作者进一步探索了单核/巨噬细胞SPP1亚群的来源，发现M1和M4簇是主要来源。
图4 浸润单核/巨噬细胞分泌SPP1诱导ACLF患者肝脏中LyECs凋亡和功能障碍
5）SPP1在诱导LyECs凋亡及功能障碍实验验证
作者进一步利用细胞免疫荧光的方法进行了验证，也发现从ACLF患者肝脏中提取的单核/巨噬细胞表达SPP1。SPP1的IHC染色显示，与HC和肝硬化患者相比，SPP1在ACLF肝脏中的表达极高。进一步验证了在体外用SPP1处理LyECs，并计算死亡的LyECs的数量。处理后的LyECs用7-AAD染色，流式细胞术检测。SPP1显著提高了LyECs的死亡率，说明SPP1可以直接损伤LyECs。此外作者还进行了血管形成实验来评估LyECs的体外功能。SPP1处理以剂量和时间依赖性的方式损害了LyECs血管形成的能力。
图5 浸润单核/巨噬细胞分泌SPP1诱导LyEC死亡，损害LyEC血管形成能力
结论
本研究利用单细胞测序技术探究HBV相关肝硬化和ACLF之间LyECs状态功能的变化，并证明了其与单核/巨噬细胞浸润和全身过度炎症有关。该研究加深了在细胞特异性水平上对ACLF的病理生理机制的认识，并有助于推进ACLF的临床和基础研究。
参考文献
Single-Cell RNA Transcriptomics Reveals the State of Hepatic Lymphatic Endothelial Cells in Hepatitis B Virus-Related Acute-on-Chronic Liver Failure. J Clin Med. 2022 May 20;11(10):2910. doi: 10.3390/jcm11102910.
