项目文章 | 单细胞转录组刻画人胶质母细胞瘤免疫微环境

发布时间：2022-07-02 10:18:34  

发表期刊：Front Immunol

发表单位：南京医科大学附属脑科医院

技术平台：新格元单细胞技术平台

用到的分析方法：单细胞聚类与注释、CNV分析、轨迹推断、细胞通讯、TCGA分析

异柠檬酸脱氢酶(IDH)-野生型胶质母细胞瘤(GBM)是最具侵袭性的脑肿瘤，预后较差。其肿瘤组织由六种主要的恶性细胞亚型组成，导致患者间和肿瘤内存在较大的异质性，给临床治疗带来了极大的挑战。

为了更全面的了解GBM患者的肿瘤微环境(TME)，揭示不同的肿瘤细胞状态与非恶性细胞之间的相互作用，南京医科大学附属脑科医院刘宏毅教授课题组、肖红教授课题组及耶鲁大学樊荣教授课题组利用新格元GEXSCOPE^®单细胞转录组建库试剂盒对7名GBM患者手术切除的原发性肿瘤进行了单细胞转录组测序。

内容导览

1、利用单细胞技术剖析GBM细胞状态与TCGA亚型的相关性

2、分析GBM发生起源细胞           

3、揭示亚型特异性免疫介质与肿瘤细胞缺氧反应

4、刻画GBM中TAMs的异质性

5、低氧特异性细胞间通讯与血管生成

6、GBM肿瘤细胞在TAM M2型极化中的作用

主要结果

1、剖析GBM细胞状态与TCGA亚型的相关性

7个GBM患者样本获得了28,279个细胞，基于CNV分析识别出GBM肿瘤细胞，所有GBM患者都有自己的主要独特CNV亚克隆，表明存在遗传异质性。

ssGSEA分析确定了六种细胞状态，AC-like、MES1-like、MES2-like、OPC-like、NPC1-like和NPC2-like状态；并将其与转录组表达及基因组改变定义的TCGA GBM亚型相关联。结果显示，AC-like细胞与TCGA经典亚型相关。MES-like细胞富含TCGA间充质亚型。作者观察到，MES-like细胞百分比较高的患者中的肿瘤也含有较高比例的肿瘤相关巨噬细胞/小胶质细胞(TAMs)。因此，如TCGA间充质亚型数据所示，MES-like细胞与浸润性TAM相关。在TCGA-neural亚型和TCGA-proneural亚型之间的富集评分中，OPC-like和NPC-like状态之间没有观察到显著差异，表明TCGA-proneural和TCGA-neural亚型在转录水平上存在重叠。

图1 应用scRNA-seq技术对原发GBM的解剖

图2 6种GBM肿瘤细胞状态的鉴定

2、GBM发育起源的谱系分析

使用RNA Velocity将所有肿瘤细胞整合在一起构建发育轨迹。发现NPC2-like细胞和GBM干细胞样细胞位于起始点，这意味着NPC2-like肿瘤细胞可能是GBM所有六种细胞状态中的起源细胞。使用regulon分析了转录因子(TF)介导的基因调控网络，在NPC2-like细胞中发现一些高度激活的转录因子与细胞周期相关，提示NPC2-like瘤细胞处于增殖状态。比较六种细胞状态的代谢水平发现，与其他肿瘤细胞状态相比，NPC2-like细胞具有更高的代谢活性，例如，三羧酸循环、氧化磷酸化和脂肪酸代谢增加。因此，处于增殖状态且代谢活性较高的NPC2-like细胞可能是人GBM发育轨迹中的起源细胞。

图3  NPC2-like细胞是GBM的起源细胞

3、亚型特异性免疫介质与肿瘤细胞缺氧反应

为了进一步了解不同的肿瘤细胞状态如何差异地影响TME以及对GBM患者预后的潜在影响。作者进行了癌症亚型特异性基因集富集分析，发现MES1-like和MES2-like肿瘤细胞与缺氧生态位有关。MES-like细胞的另一个特征是诱导免疫介质，包括激活IL2/STAT5信号通路等。此外，MES1-like和MES2-like肿瘤细胞高表达免疫因子，这些免疫因子在形成免疫抑制的TME中发挥重要作用。这与前面的结果一致，即MES-like细胞与浸润性TAMs相关，从而促进了免疫抑制环境和肿瘤的进展。尽管MES-like细胞处于静止状态，但它们与促进侵袭的微环境有关，具有较高的TGFβ信号通路和上皮-间充质转化(EMT) 活性。这些结果提示，MES1-like和MES2-like肿瘤细胞产生可溶性介质来调节TME，并导致不良预后。

图4 GBM中的低氧反应性肿瘤细胞

4、GBM中TAMs的异质性

TAMs是GBM基质细胞的主要成分，聚类识别了4个具有不同表达模式的TAM簇。TAM-0簇与细胞因子产生和脂蛋白代谢有关，高表达趋化因子和脂蛋白受体。TAM-2簇处于细胞周期中，并过表达其他与细胞周期相关的基因。TAM-3簇能对干扰素产生反应。TAM-1簇可以对GBM中氧水平降低做出反应。MES-like细胞和TAM-1簇都与GBM缺氧生态位有关。推测低氧反应的TAM-1簇，可能与预后不良有关。通过构建TAM的转录因子网络，发现缺氧相关的调节因子EPAS1和HIF1α在TAM-1簇中都被激活，这与MES1和MES2-like肿瘤细胞的缺氧反应不同。提示GBM缺氧生态位可分为急性缺氧微环境和慢性缺氧微环境两种情况：MES样肿瘤细胞仅存在于慢性缺氧生态位，而TAM-1则分布于两种缺氧生态位。通过TCGA胶质瘤数据分析发现，TAM-1簇与预后不良密切相关。TAM-1标志物评分低的患者比TAM-1标志物评分高的患者存活时间更长。

图5 GBM中缺氧响应的TAM

5、低氧特异性细胞间通讯与血管生成

CellChat确定了不同细胞类型之间显著的配体-受体相互作用，生成了细胞间特定的communtion模式。模式5被发现是这些GBM缺氧反应细胞所特有的，即MES1-like肿瘤细胞、MES2-like肿瘤细胞和TAM-1。其中，大部分配体-受体对靶向内皮细胞。此外，还发现这些由缺氧相关的GBM细胞分泌的配体，可能通过例如ADM、ANGPTL4、GDF15和VEGFA刺激血管生成。且GBM中只有MES1-like瘤细胞、MES2-like瘤细胞和TAM-1表达VEGFA。这些结果表明，低氧依赖的GBM细胞类型促进了血管生成。广泛的肿瘤血管生成和内皮细胞增殖是GBM的标志，肿瘤血管丰富与预后不良显著相关。

图6 低氧反应细胞在血管生成中的作用

6、GBM肿瘤细胞在TAM M2型极化中的作用

基于scRNA-seq数据预测从GBM肿瘤细胞到TAMs的配体-受体对(L-R)，发现六种GBM细胞状态的肿瘤细胞都会分泌配体，针对TAM M2类型的标志物基因来诱导激活。因此，这些TAM将逐渐转变为M2表型，然后促进GBM的进展。与其他细胞状态相比，MES-like肿瘤细胞分泌更多的促进配体，这也部分解释了为什么MES-like肿瘤细胞与不良预后相关。

图7 GBM肿瘤细胞在促进TAM M2型极化中的作用

结论

1、NPC2-like肿瘤细胞可能是GBM的起源细胞。

2、MES1-like和MES2-like肿瘤细胞与免疫浸润及慢性缺氧性生态位反应密切相关。

3、发现一个肿瘤相关巨噬细胞/小胶质细胞(TAM)亚群兼具急性和慢性缺氧反应特征，与肿瘤血管生成、侵袭和不良预后有关。

4、MES-like GBM细胞表达最多的TAM M2型促进配体。

参考文献

Xiao Yong, Wang Zhen, Zhao Mengjie, et al. Single-Cell Transcriptomics Revealed Subtype-Specific Tumor Immune Microenvironments in Human Glioblastomas. [J]. Front Immunol, 2022, 13: 914236.