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项目文章 | 单细胞测序揭示共刺激分子CD226对胸腺T细胞发育的影响
发布时间:2022-12-29 15:40:03  

2022年11月,第四军医大学联合西北工业大学在学术期刊IMMUNOLOGY上发表题为“CD226 knockout reduces the development of CD8+ T by impairing the TCR sensitivity of double-positive thymocytes”的研究成果。本研究通过对野生型(WT)和CD226基因敲除小鼠(KO)的胸腺细胞进行单细胞测序,探索了共刺激分子CD226对于T细胞发育的重要作用。实验发现,CD226KO小鼠胸腺中CD8+ T细胞显著减少,DPT-Q细胞显著增加,并且削弱了TCR信号通路中AKT的磷酸化水平,促进DPT细胞凋亡,表明CD226对胸腺细胞发育有重要影响。新格元在该研究中承担了单细胞转录组测序以及单细胞数据生信分析等工作。

下面和元小新一起来看一下单细胞如何揭示共刺激分子CD226对T细胞发育的影响吧~

 

研究背景

 

T淋巴细胞在胸腺发育成熟,其经历的阳性选择是表达不同TCRs的未成熟双阳性(DP) T细胞成熟为MHC限制性单阳性(SP) T细胞的关键步骤。CD226是一种I型跨膜活化性受体,以往对CD226功能的研究主要集中在外周组织中调节免疫的作用。CD226信号通路促进CD8+ T细胞活化,增强细胞毒性,它对抗肿瘤免疫至关重要,但在胸腺细胞发育过程中其特征尚不明确。

DPT:共表达CD4/CD8,双阳性T细胞(DPT);

DPT-Q:DPT at the quiescent phase静止期的DPT细胞;

DPT-P:DPT at proliferating phase增殖期的DPT细胞;

DNT:双阴性T细胞。

 

思维导图

 

 

研究结果

 

1.scRNA-seq揭示了CD226在胸腺T细胞发育中的意义

为了确定CD226分子在胸腺T细胞发育中的作用,研究者使用Singleron GEXSCOPE平台对5周龄CD226 KO小鼠和对照的野生型(WT)小鼠的胸腺细胞进行了scRNA-seq(图1a)。通过质量控制并分别获得了26962个(WT)和26283个(KO)胸腺细胞;利用UMAP对细胞群进行识别和可视化,大多数胸腺细胞被鉴定为T细胞(图1b)。然后将T细胞进一步细分聚类为7个亚群,然后使用之前报道的marker进行了注释(图1c),并对T细胞每个cluster的前10个特征基因进行了展示。拟时序分析显示,WT和CD226KO小鼠的胸腺细胞发育轨迹如下:DNT、DPT-P、DPT-Q、CD4+/CD8+ SP T细胞(CD4/CD8 T)(图1c,e),这与前人的报道一致。

图1 scRNA-seq揭示了CD226在胸腺T细胞发育中的重要性

 

CD226 KO组胸腺细胞各亚群的分布和比例发生了显著变化(图2a)。与WT小鼠相比,CD226KO小鼠的CD8+ SP胸腺细胞比例显著降低,DPT-Q细胞比例显著增加(图2a,b)。然后,研究者又通过流式细胞术分析证实,CD226敲除降低了胸腺中CD8 T细胞的比例,增加了DPT细胞的比例(图2c)。通过对DPT-Q、CD4+ T和CD8+ T细胞进行Monocle 2拟时序表明,CD226敲除一定程度上阻止DPT-Q分化为CD8+ T细胞(图2d,e)。提示CD226在胸腺T细胞的发育过程中起重要作用,尤其是在DPT-Q向CD8+ T细胞的转化过程中。

图2 CD226敲除破坏胸腺T细胞发育

 

2.CD226在DPT期开始高表达 

基于CD226在胸腺T细胞发育中的重要作用,研究者检测了WT小鼠中不同发育阶段的T细胞中CD226的表达情况。首先是通过jitter图显示了在T细胞分化的假时间过程中CD226的表达(图3a),发现:CD226不表达于DNT期之前的各阶段胸腺细胞,在DPT-Q期开始表达,在CD4+、CD8+和NKT细胞等终末分化T细胞中表达最高。接着,采用流式细胞术检测WT小鼠胸腺中CD226蛋白的表达水平,发现:CD226水平按照DNT、DPT、CD4+ T和CD8+ T细胞的顺序逐渐升高,其中CD226在DNT中表达最低,但在DPT期显著升高(图3b,c)。这表明CD226在DPT细胞中起重要作用。此外,CD8+ T细胞中CD226的表达显著高于其他亚群,这可能是CD226敲除主要影响了CD8+ T细胞发育和功能的原因之一。

图3 CD226在DPT期开始高表达

 

CD226敲除抑制DPT-Q向CD8+ T细胞的发育,DPT-Q是T细胞向SP细胞发育的关键阶段。接下来,文章作者进一步对DPT-Q细胞展开研究。首先将DPT-Q细胞进行进一步分群,分为5个亚群,使用UMAP进行数据分析和可视化(图4a)。通过UMAP图可以看出,CD226敲除导致DPT-Q中缺少簇2、3和5(图4c)。同时作者也对这些亚群的特征基因以热图的形式进行了展示。簇2可以由Granzyme A (Gzma)注释(图4e),而Granzyme A是一种选择性地表达于CTL和NK细胞的丝氨酸蛋白酶,诱导肿瘤细胞和病毒感染细胞死亡,表明Gzma+ Cluster 2可能进一步发展为CD8+ T细胞。这些结果表明,CD226敲除抑制DPT-Q的发育,Gzma+亚群的缺失可能是CD8+ T发育障碍的潜在原因。

图4 CD226敲除阻碍DPT-Q向CD8+ T细胞的发育

 

3.CD226的缺失通过减弱TCR信号强度阻碍了T细胞的阳性选择

DPT-Q期的阳性选择对T细胞向SP(单阳性)细胞的发育至关重要,DPT细胞只有接收到合适强度的TCR信号,才能通过阳性选择,继续存活和成熟。CD5的水平在阳性选择过程中受到严格的调控,并且CD5的表达反映了TCR转导信号的强度,CD5+ Cluster 3被鉴定为正在发生阳性选择的DPT细胞。接下来,文章作者对CD5+ Cluster 3细胞展开了研究,jitter图显示CD5表达增加,之后随拟时序顺序降低,反映了DPT细胞经历阳性选择的动态过程(图5a)。鉴于CD226敲除造成CD5+ Cluster 3细胞的显著减少(图4c),文章作者进一步研究了CD226是否影响DPT细胞的TCR信号强度。基于scRNA-seq的气泡图显示,CD226 KO小鼠的DPT-Q和CD5+ DPT-Q细胞中TCR下游信号分子如Lck、Lat和Zap70的基因表达均下调(图5b)。WT和CD226 KO 组DPT细胞之间差异基因的富集分析指向TCR下游的MAPK等相关信号通路(图5c)。GO富集分析也显示了TCR信号的一致结果,如分子功能中的转录因子和蛋白激酶结合,细胞成分中的细胞质,以及生物过程中的细胞分化(图5d)。

图5 CD226基因敲除减弱了阳性选择中的TCR信号强度

 

4.CD226通过调控AKT活性调控DPT细胞凋亡

细胞凋亡是胸腺细胞进行阳性选择和决定成熟单阳性T细胞数量的最重要机制,研究者通过流式细胞术检测了WT和CD226KO小鼠胸腺细胞凋亡水平。WT胸腺细胞和CD226KO胸腺细胞中CD4+和CD8+ SP细胞的百分比没有显著差异,而CD226缺陷的DPT细胞显示出更高的凋亡水平(图6a)。

AKT通路参与细胞存活/凋亡的调节,当TCR被激活时,其下游元件NF-κB、AKT和MAPK发生级联磷酸化。然而,在CD226缺陷的DPT细胞中,AKT在Ser473位点的磷酸化、ERK在Thr202/ Tyr204位点的磷酸化、NF-κB在Ser536位点的磷酸化和P38在Thr180/Tyr182位点的磷酸化显著降低(图6b)。与WT DPT细胞相比,CD226缺陷的DPT细胞表现出更高的凋亡水平,AKT激活剂SC79显著逆转了这种凋亡水平(图6c)。

同时,促凋亡相关蛋白Bax和cleaved-caspase 3在CD226缺陷的DPT细胞中表达上调。AKT抑制剂增强了DPT细胞中Bax和cleaved-caspase 3的表达,AKT激活剂显著逆转了CD226缺陷的DPT细胞中Bax和cleaved-caspase 3的上调(图6d)。上述结果表明,CD226可以通过调节AKT活性来调控DPT细胞凋亡,TCR信号强度减弱是CD226 KO小鼠阳性选择受损和胸腺细胞发育障碍的原因。

图6 CD226敲除通过调控AKT磷酸化促进DPT细胞凋亡

 

结论

1、本研究对WT和CD226 KO小鼠胸腺细胞进行了单细胞测序,CD226KO小鼠胸腺中CD8+ T细胞显著减少,DPT-Q细胞显著增加,表明CD226对胸腺细胞发育有重要影响。

2、研究了CD226在胸腺细胞各发育阶段的动态表达规律,发现其在DPT时期开始高表达。

3、DPT-Q细胞被细分为5个细胞亚群,包括CD5高表达的细胞群,而CD226 KO组胸腺中明显缺乏CD5表达,而另一簇Gzma+ DPT-Q亚群在CD226 KO胸腺中同样缺失,表明DPT-Q向CD8+ T细胞发育过程受损。

4、CD226 KO降低了多个TCR下游分子基因的表达,CD226缺陷导致多个TCR信号通路相关的差异基因富集,包括MAPK通路。

5、通过体外实验发现CD226敲除增加了DPT细胞的凋亡水平,而AKT激活剂可以在很大程度上逆转CD226缺失的DPT细胞的凋亡增加。

综上所述,CD226在DPT细胞阳性选择过程中协同pMHC-TCR相互作用,为DPT-Q细胞向SP阶段的发育提供足够强度的刺激信号,其分子机制与AKT通路抑制DPT细胞凋亡有关,参与胸腺细胞发育的调节。该发现为共刺激分子CD226在T细胞分化和成熟中的调节作用研究提供了新的实验数据和思路。

 

参考文献

Jingchang Ma ,Yitian Liu , Chujun Duan  et al.  CD226 knockout reduces the development of CD8+ T by impairing the TCR sensitivity of double-positive thymocytes. Immunology. 2022 Nov 24. doi: 10.1111/imm.13612.

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