1.不同刚度水凝胶中NPC的分化

该研究利用DNA及其镜像异构体制备了2种具有相同的网络拓扑结构和机械性能，但不同生物可降解性的DNA水凝胶(L-DNA：无生物可降解性，D-DNA：具有生物可降解性)。同时每种水凝胶设置了3种刚度。

利用不同刚度的水凝胶对NPC进行3D培养，在培养1d和3d收集细胞，0d的细胞作为对照组共13例样本进行单细胞转录组测序，经质控后最终获得107447个细胞，无监督聚类分成了11个簇。根据相应标记基因的特异性表达和通路富集分析鉴定出少突胶质细胞(oligo)、2种基质细胞(stromal-1、stromal-2)、循环细胞(cycling)、雪旺细胞(Schwann)、gNPC-1(胶质细胞分化状态下)、nNPC(神经元分化上调)、sNPC(细胞对外部刺激有反应)、wNPC(具有伤口愈合功能)、gNPC-2(胶质细胞生成和伤口愈合)和dNPC(细胞分裂状态下)。

从第0天到第3天，增殖细胞(dNPC和cycling)的比例平均从11%下降到1.5%，而成熟少突胶质细胞的比例增加了约20倍，表明NPC在3D DNA水凝胶中会随着时间的推移而分化成熟。在第1天，刚性D-DNA水凝胶组wNPC和sNPC的比例大约是中度凝胶和软凝胶组的2倍。在第1天和第3天，当水凝胶的刚度降低时，gNPC-1的比例增加了约40%。相比之下，在不同刚度的L-DNA水凝胶中，细胞簇比例没有明显变化(均小于8%)。对比D-和L-DNA组，随着刚度的变化，D-DNA组细胞簇比例不同，而L-DNA组细胞簇比例随刚度的变化不显著，说明NPC的分化可能与D-和L-DNA水凝胶的性质差异有关。

使用monocle和CytoTRACE进一步分析了NPC在水凝胶中的分化状态。轨迹分析显示细胞分为3种状态(state1-3)。在0d中，处于state1、2、3的细胞比例分别为36%、31%、33%。在L-DNA水凝胶中，即使仅培养1天，大多数细胞也会过渡到state3，且NPC的转变随水凝胶的刚度没有明显变化。这些结果表明，在单变量力学控制下，不管L-DNA水凝胶中的刚度如何，NPC的分化都是独立进行的。同时，D-DNA组与L-DNA组在细胞转化百分比上存在显著差异，D-DNA组在state1和state2两种状态下的细胞积累比例均较高，提示NPC在2种水凝胶中的分化途径不同。

图1 NPC分化与水凝胶的可降解性有关

2.D-DNA水凝胶的降解促进细胞-细胞相互作用

随着孵育时间的增加，D-DNA水凝胶的变性PAGE中可以观察到明显的降解带，同时水凝胶的存储模量(G’)迅速下降，而L-DNA水凝胶没有明显的降解带和下降趋势。推测降解可以诱导嵌入的细胞聚集形成细胞簇，这可能促进细胞间的相互作用并影响细胞的分化途径。

CellphoneDB分析显示，D-DNA组的互作对数比L-DNA组多。其中，在D-DNA水凝胶中，wNPC、gNPC-2与stromal cells之间的相互作用明显较多，与ECM的组织和再生有关。在D-DNA水凝胶中，分泌的生长因子与其受体(如转化生长因子β(TGFB)、成纤维细胞生长因子(FGF)和表皮生长因子(EGF))之间的细胞-细胞相互作用是显著的，这些因子调节神经干细胞的自我更新和神经发育。L-DNA水凝胶中具有显著细胞-细胞相互作用对明显较少，其中MERTK-GAS6负责Schwann cells(10)与其他细胞(gNPC(1和2)、wNPC(4)和oligo(6)之间的相互作用，并影响Schwann cells的增殖过程。这些结果表明，与L-DNA水凝胶相比，可降解D-DNA水凝胶中通过旁分泌信号和直接接触的细胞-细胞相互作用更多。

图2 水凝胶降解通过调节细胞间相互作用调节NPC分化

3.D-和L-DNA水凝胶的细胞分化机制

为了进一步阐明NPC在D-和L-DNA水凝胶中的分化机制，通过GeneSwitches分析比较了从state1到2路径和从state1到3路径之间的不同开关基因。NPC从state1向state2分化过程中凋亡途径上调，可能是state2细胞在培养3天后减少的原因。从state1到state3的分化过程中细胞获得远端轴突和极化生长相关功能的位点，表明处于state3的NPC正常分化。

由于嵌入的干细胞在凝胶中的聚集可以阻止有效的分化，假设D-DNA组中比L-DNA组中更多的细胞过渡到state2是由细胞聚集引起的，因为聚集物内部和外部的细胞可能通过不同的方式感知外部刺激。通路富集分析显示，与state3相比，state2中上调的基因在细胞对外界刺激(尤其是机械刺激)的反应、细胞迁移、伤口愈合、细胞外基质、整合素结合、蛋白酶结合等方面显著富集，与ECM重塑相关。由于细胞可以在可降解的动态水凝胶中沉积新生蛋白和重塑基质，推测更多细胞在可降解D-DNA水凝胶中过渡到state2可能依赖于ECM重塑，这可以促进细胞之间的相互作用，增强外部刺激感知。因此，机械刺激可能在D-DNA水凝胶中通过新生蛋白进行转导，而在L-DNA水凝胶中则不能。

对于L-DNA水凝胶，没有特异性的黏附配体修饰和可能的ECM重塑，为嵌入的细胞创建了具有均匀压力和单变量机械强度的三维限制，不太可能诱导激活机械感应通道的显著膜变形。因此，所有这些结果都证明了单变量机械强度在没有额外配体修饰的均匀三维水凝胶中不影响NPC的分化，L-DNA水凝胶可以被认为是一个理想的三维细胞培养体系。