AS事件包括外显子跳跃(SKIP)、盒式外显子(MSKIP)、单内含子保留(IR)、多内含子保留(MIR)、选择性外显子(AE)、选择性转录开始(TSS)选择性转录终止(TTS)在本研究中，OA组的TSS数量超过178,671个，其中一半是新转录本。MIR_ON类型最少。每种类型的转录本在生殖细胞和气孔细胞中占相似的百分比（图4A），OA体细胞中TTS和TSS含量低于生殖细胞(图4B)。
图4 精子发育细胞状态的鉴定
4、长读长转录组在不同精子发生阶段的表达
在精子发生的特定阶段，有超过2000个基因表达。已知的SSC标记包括UTF1、ID4和FGFR3，而分化标记包括KIT和DMRT1。然而，长读长转录组(SE-LRT)的特异性表达尚不清楚。在这里，不同的长转录组在生殖细胞和体细胞中特异性表达(图5A左)。并在NOA和OA之间存在显著差异(图5A左)。NOA组内皮细胞有13种SE-LRT, OA组无。OA(JUN、HSPA1A、SPARC、 CALM1、AARD)和NOA(MT-RNR2、PSMA7、RAB31、SERPINA5、GATM)的SE-LRT差异有显著性意义，提示NOA对睾丸微环境有显著影响。
图5 PacBio scRNA-seq揭示序列多样性
5、OA中表达的长读长转录组基因组结构
AS可以从单个基因中产生多种mRNA，然后将其翻译成不同的氨基酸序列，从而产生具有不同功能的蛋白质异构体。在本研究只有CCNI在SSCs中有特殊表达。在精原细胞中发现 HMGB1和PTMA两个SE-LRT。在粗线期检测到10个SE-LRTs，表明粗线期中SE-LRTs的数量多于其他生殖细胞。还检测到a novel PABPC1 isoform在粗线期表达，鉴定了其他关键SE-LRT基因，包括RNFT1、SPAG6、CCT3、LYAR、CLGN和RPN2。SE-LRT未在中期和圆形精子中检测到。每个基因都有不同的长读长转录组结构，可以产生不同种功能蛋白。SE-LRT可能在相应的生殖细胞中发挥独特的作用。SE-LRT可能在相应的生殖细胞中发挥独特的作用。
图6 AS事件转录本的基因组结构，不同细胞类型样品中基因转录本结构的多样性
6、支持细胞(Sertoli)表达的长读长转录组的基因组结构
约50%的不孕症病例与男性有关，尤其是精子发生障碍。唯支持细胞综合征(SCOS)在男性中很常见，其特征是生殖细胞发育不全。支持细胞通过调控睾丸微环境，维持精原干细胞稳态，协助精母细胞完成减数分裂以及圆形精子变态发育，并将成熟的精子释放到精小管管腔参与精子发生。本研究在OA的支持细胞中发现了5种SE-LRT，包括JUN、SPARC、HSPA1A、AARD和CALM1(图7a)。其中，在NOA的Sertoli细胞中发现了SERPINA5、GATM、RAB31、PSMA7和MT-RNR2 5种SE-LRTs(图7b)。包括SERPINA5、GATM、RAB31、PSMA7和 MT-RNR2在NOA的支持细胞中被发现。与OA相比，NOA病理状态下支持细胞丢失了部分重要基因的正常表达，其中该部分基因丢失可能引起支持细胞功能障碍，从而导致睾丸衰老从而引起精子发生障碍。这可能会导致睾丸微环境衰竭。
图7 Sertoli细胞特异性表达转录本的基因组结构
7、长读长转录组的新基因组结构
支持细胞骨架主要由肌动蛋白和微管(MT)组成，支持精子发生。这些细胞骨架是毒物诱导男性生殖功能障碍的目标。在本研究中，NOA中肌动蛋白的结构发生了变化(出现了额外的外显子)。在我们的研究中，NOA没有长外显，这表明H3f3B可能在支持细胞中发挥重要作用，从而支持精子发生(图8A)。基因间转录本和反义转录本被定义为新基因。在此，我们选择了OA和NOA的4个新基因及其结构。在OA中，新基因61435与MAGEC2位置重合(图8B)。Novel Gene CLNS1A_AS在NOA中仅包含两个外显子，而Novel Gene serpin1_as由三个外显子组成(图8C)。
图8 新转录物和基因的基因组结构
