单细胞分析揭示抗PLA2R阳性特发性膜性肾病患者的转录特征和细胞串扰
发布时间：2021-08-24 13:18:05
近日，中南大学湘雅医院肾内科周巧玲教授和钟永博士团队，采用新格元单细胞技术特发性膜性肾病(IMN)单细胞研究成果，在《Frontiers in Immunology》，题为：“Single-Cell Profiling Reveals Transcriptional Signatures and Cell-Cell Crosstalk in Anti-PLA2R Positive Idiopathic Membranous Nephropathy Patients”。文章采用6名抗PLA2R阳性IMN患者和2名健康对照受试者的肾脏组织，利用新格元海量单细胞转录组测序技术获得高质量的单细胞测序数据，助力IMN单细胞研究，以发现细胞间的相互作用，阐明发病机理的关键途径。
研 究 背 景
特发性膜性肾病(IMN)是成人肾病综合征(NS)的常见病因，发病高峰50-60岁。IMN是肾小球的一种器官特异性自身免疫性疾病，它可能会逐渐发展为以蛋白尿增加为特征的终末期肾病(ESRD)，从而导致严重的后果。在过去的10年中，对IMN分子基础的理解已取得了重大进展，鉴定了几种抗原：中性肽链内切酶、M型磷脂酶A2受体(phospholipase A2 receptor, PLA2R)、含有 7A 的血小板反应蛋白域 (THSD7A) 和自体抗原结合结构域。根据疾病活动的状态，50%到80% 的患者可以通过任何可用的测试检测出抗PLA2R抗体阳性，这些突破性的发现已经对诊断和治疗监测产生了重大影响。此外，几个风险等位基因HLA-DQ、HLA-DR和PLA2R1已被确定为IMN的致病风险基因。IMN的发病机制是自身抗体结合足细胞靶抗原后激活补体导致肾小球滤过屏障损伤和蛋白尿。
研 究 流 程
取6名抗PLA2R阳性IMN患者和2名健康对照受试者肾活检样本被酶解成单细胞悬液，并加载到微流控装置上进行细胞条形码标记、细胞裂解、RNA反转录，然后是单细胞 RNA 测序分析以及细胞分群，Marker基因展示，差异表达基因(DEG)的鉴定和富集分析以及细胞之间的相互作用。
研 究 结 果
scRNA-seq技术鉴定肾脏中的细胞谱系
为了定义单细胞分辨率下的转录组情况，使用单细胞RNA测序分析了6名抗PLA2R阳性IMN患者和2名健康对照受试者的肾脏样本。基于scRNA-seq技术，经过数据预处理和严格的质量控制，最后将 30313 个细胞进行了后续的分析。聚类注释共得到11 个肾脏亚群和 6 个免疫亚群，每个集群由至少有 21 个细胞到13792 个细胞组成(图 1B)。来自八个不同肾脏受试者的细胞分布利用UMAP进行可视化展示(图 1C)。计算了每个样本不同细胞类型的的占比(图 1D)。每个细胞类型top 20 差异基因(图1E)，所选的细胞类型特异性Marker基因展示(图1F)。
图1 在抗 PLA2R 阳性 IMN 和对照受试者中通过单细胞 RNA 测序进行的细胞谱系分析
抗PLA2R阳性IMN受试者肾细胞中DEG的鉴定和富集分析
为了探索肾实质细胞中的基因表达变化，作者对IMN 患者和健康供体之间的转录组进行了差异表达分析。作者通过比较 IMN 和对照受试者之间的转录谱，定义了肾小球内在细胞(图 2A)和肾小管内在细胞(图 2B)中的代表性 DEG 。GO富集分析显示，DEGs在系膜细胞凋亡和I型干扰素信号通路的调控、内皮细胞程序性细胞死亡和多种细胞因子介导的信号通路的调控以及周细胞蛋白质修饰的调控中富集(图 2D)，而KEGG富集分析显示DEG主要与内皮细胞和周细胞中的IL-17信号、TNF信号、NOD样受体信号和MAPK信号通路相关(图2E)。
图2 抗PLA2R阳性IMN和对照受试者肾细胞中的DEG和富集分析
抗PLA2R阳性IMN中通过配体-受体相互作用的细胞间串扰
为了探索IMN中不同细胞亚群的相互作用和信号网络，进行了配体-受体分析。图3A显示了不同肾脏细胞类型中受体和配体的潜在相互作用。系膜细胞表达的CXCL1、CXCL8或CCL2与内皮细胞中的ACKR1相互作用(图 3B)。在FGFR1表达的系膜细胞抑制下，足细胞表达的FGF1可能通过PI3K/AKT抑制氧化应激和炎症来改善慢性肾病 (图 3C)。此外，PT表达PTPRK，这是一种重要的细胞-细胞粘附调节剂，通过蛋白质酪氨酸残基的可逆磷酸化实现，发现它可能与来自系膜细胞的 BMP7 相互作用(图 3D)。由Henle细胞环表达的 EGF与系膜细胞中的EGFR或NGR1相互作用(图 3E)，这可能在细胞增殖中起作用。系膜细胞高度表达 SPP1并与来自成纤维细胞的PTGER4形成相互作用对(图 3F)，可能与T细胞的激活有关。除了成纤维细胞中的 PTGER4，作者发现系膜细胞中的 SPP1 可能与巨噬细胞中的 PTGER4 相互作用(图 3G)。
图3 抗PLA2R阳性IMN患者肾脏中不同细胞类型之间可能的配体-受体对
大量蛋白尿组和非大量蛋白尿组抗PLA2R阳性 IMN患者的DEG和富集分析
通过UMAP降维图展示了来自 IMN 患者的大量蛋白尿组和非大量蛋白尿组之间的细胞分布(图 4A)。分组依据蛋白尿是否达到肾病综合征范围，即3.5g/24h。然后，比较了来自 IMN 患者的大量蛋白尿组和非大量蛋白尿组之间的蛋白尿DEG。如图4B，C，KEGG 和GO富集分析表明，与非大量蛋白尿受试者相比，大量蛋白尿组上调的DEG主要参与凋亡、细胞粘附、炎症和免疫反应的调节。
图4 大量蛋白尿组和非大量蛋白尿组抗 PLA2R 阳性 IMN 患者的 DEG 和富集分析
研 究 结 论
T本文使用单细胞RNA测序分析了8个肾脏样本，通过无监督聚类分析确定了不同的细胞簇。还进行了差异表达基因(DEG)的鉴定和富集分析以及细胞之间的相互作用。基于转录表达模式，作者鉴定了肾脏中所有先前描述的细胞类型。大多数肾脏实质细胞中的DEG主要富集在炎症和免疫反应调节相关信号通路，包括IL-17信号传导，TNF信号传导，NOD样受体信号传导和MAPK信号传导通路。此外，细胞间串扰突出了肾小球系膜细胞的广泛交流，这在IMN中具有重要意义。具有大量蛋白尿的IMN显示参与炎症信号通路的基因表达升高，炎症信号通路可能与IMN的发病机制有关。总体而言，作者将单细胞RNA测序应用于IMN，以发现细胞间的相互作用，阐明发病机制的关键途径。
