项目文章|单细胞分析揭示妊娠期并发子痫前期滋养层细胞转录异质性
发布时间：2021-08-26 10:35:00
近日，山东中医药大学附属潍坊市中医院产科张涛博士团队，采用新格元GEXSCOPE®单细胞技术在《Mol Genet Genomic Med》上发表研究子痫前期(Pre-eclampsia)单细胞研究成果，发表题为：“Dissecting human trophoblast cell transcriptional heterogeneity in preeclampsia using single-cell RNA sequencing”。
文章采用3名子痫前期产妇和3名健康产妇的胎盘组织，利用新格元海量单细胞转录组测序技术获得高质量的单细胞测序数据，助力PE单细胞研究，以发现新的细胞亚型及细胞间差异基因，阐明发病机理的关键途径。
研 究 背 景
子痫前期(PE)是一种妊娠期间并发的特异性综合征，发生率约为3%-5%。通常在妊娠晚期表现为新发的高血压和蛋白尿。PE进展很快，可能会导致严重的并发症，包括母亲和胎儿的死亡。在低收入国家，PE是孕产妇和儿童死亡的主要原因之一。虽然对PE的病因仍有争议，但临床和病理研究表明胎盘在PE的发病机制中起着重要作用。
研 究 流 程
将3名子痫前期产妇和3名健康产妇的胎盘组织酶解成单细胞悬液，并加载到微流控装置上进行细胞条形码标记、细胞裂解、RNA反转录，然后是单细胞RNA测序分析以及细胞分群，Marker基因展示，拟时序分析，差异表达基因(DEGs)的鉴定和富集分析。
研 究 结 果
scRNA-seq技术鉴定胎盘中的细胞类型
从6名妇女的胎盘组织中获得了11518个细胞，PE组6434个胎盘细胞包括免疫细胞(3562个细胞，55.36%)、滋养层细胞(2507个细胞，38.96%)、成纤维细胞(157个细胞，2.4%)、红细胞(142个细胞，2.2%)和内皮细胞(66个细胞，1.0%)。在健康妊娠组中，检索到类似的细胞异质性分类。PE组(GT01)和健康妊娠组(XG01)均可检测到大量巨噬细胞和滋养层细胞，其中自然杀伤细胞(NK细胞)和T细胞在PE组较高。
滋养层细胞可以进一步细分为EVT、VCT和SCT。EVTs(1216个细胞，占48.5%)是PE组最丰富的滋养层细胞类型，其次是VCTs(1000个细胞，39.9%)和SCTs(291个细胞，11.6%)。
图1 PE组和健康妊娠组通过单细胞 RNA 测序进行的细胞谱系分析
子痫前期产妇与健康产妇滋养层细胞差异表达基因的鉴定
为了探究PE孕妇胎盘组织中滋养层细胞基因表达的变化，作者分别对PE组和正常妊娠组三种滋养层细胞的转录组进行了差异表达分析。
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SCTs：GSEA分析发现内质网途径中与蛋白质加工相关的基因在PE组上调，表明内质网功能在疾病状态下处于活跃状态。这被认为与狭窄螺旋动脉引起的胎盘间歇性缺氧有关。GO富集分析显示DEGs在白细胞介素-8的产生和白细胞介素-8产生的调节上显著富集。
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VCTs：GSEA分析显示PE组核糖体途径相关基因表达下调。GO富集分析生物过程主要集中在先天免疫反应和细胞趋化性。
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EVTs：GSEA分析发现PE组单纯疱疹病毒感染途径相关基因表达上调。GO富集分析发现多数DEGs与先天免疫反应和对细胞因子的反应有关。PE组VCTs和EVTs细胞功能主要集中在免疫应答上，提示PE患者胎盘免疫功能发生了改变。
图2 滋养层细胞的DEGs和富集分析
拟时序分析揭示滋养层细胞间的发育分化关系
曾有研究提出滋养细胞亚型之间存在一定的发育分化关系，为了描述这种关系并研究调控这一过程的基因，作者使用UMAP重新聚类分析，从这三个簇中鉴定出高度可变的基因。通过对细胞运动轨迹的分析，发现VCT处于细胞发育的早期阶段。且PE组和健康妊娠组的滋养细胞发育均呈连续的“Y”字形轨迹。Flt1、FN1和TIMP3沿着SCTS的分化途径特异性上调。
图3 滋养层细胞的发育轨迹
滋养层细胞新亚型的鉴定
对VCT细胞进一步进行亚型细分，发现VCT-1、VCT-2和VCT-3三个细胞亚群，其中VCT-2细胞主要分布于PE组，VCT-3细胞主要分布于健康妊娠组。
图4 滋养层细胞亚型
将VCT-2基因的表达与其他滋养细胞基因进行比较。通过GSEA分析结果发现，与蛋白酶体、剪接体和核糖体途径相关的基因表达上调，而与抗原处理和提呈相关的基因表达下调。且蛋白酶体相关基因，如PSMA7和PSMC1，在VCT-2差异基因集中有不同程度的上调。GO富集分析发现VCT-2中多数DEGs与细胞呼吸、有机化合物氧化所产生的能量以及前体代谢物和能量的产生有关。表达水平上调的基因包括与细胞呼吸链相关的线粒体编码基因。将VCT-3与其他滋养细胞进行比较，所有差异基因的GSEA分析结果表明，与代谢途径和阿尔茨海默病途径相关的基因表达上调。与自然杀伤细胞介导的细胞毒性和类风湿性关节炎相关的基因表达下调。基于GO分析的结果来看，VCT-3参与了核转录的mRNA分解代谢过程，并以共翻译蛋白为靶向膜。相关基因有：RPL23A和RPS14等.
图5 滋养层细胞亚型的DEGs和富集分析
研 究 结 论
本文使用单细胞RNA测序分析了6例胎盘组织样本，通过无监督聚类分析确定了不同的细胞簇。还进行了差异表达基因(DEGs)的鉴定和富集分析。基于转录表达模式，作者鉴定了胎盘组织中的已知三种滋养层细胞。并通过拟时序分析了三种滋养层细胞间的发育分化轨迹。首次确定了VCT的三种亚型并且找到了其中一种特殊的滋养层细胞亚型可能与产妇发生子痫前期有关。该研究丰富了人类对胎盘及其在疾病状态下的分子功能的理解。这些发现将有助于未来新的分子标志物的发现和治疗该疾病的药物的研发。
