项目文章 | 单细胞测序联合其它前沿技术，多管齐下共同揭示新冠患者的宿主反应
发布时间：2021-10-08 11:43:35
自2019年12月出现后，COVID-19已成为1918大流感以来最具挑战性的流行疾病。致病病原体SARS-CoV-2具有高度传染性，目前已在全球范围内累计感染超过2亿人，死亡人数也已突破400万。而在国内，近期新冠疫情在江苏、河南、福建等地接连爆发，说明COVID-19的阴霾仍未远去，还需要我们保持足够的警惕，对疾病做出全面的解析。
COVID-19在患者身上表现出一系列症状，从最初的上呼吸道感染，到肺部肺泡上皮细胞感染和随后的肺炎，过度炎症会引起肺上皮-内皮屏障损伤。当疾病发生恶化时，还会导致免疫系统的全身性紊乱和多种器官衰竭。在重症患者中会出现淋巴细胞减少症和细胞因子释放综合征(CRS)，但是对于这种情况产生的分子和细胞机制仍需要进一步探索。为了深入了解COVID-19 的病理生理学，以及COVID-19的严重程度与宿主反应之间的关系，上海交通大学转化医学国家重大科技基础设施(上海)首席科学家、中国工程院院士陈赛娟院士、刘峰教授、谭云博士团队，利用新格元的单细胞测序技术结合临床实验检测、靶向蛋白组和bulk转录组等技术对SARS-CoV-2感染和恢复过程中不同时间段的患者进行了全方位的分析，提供了COVID-19发展过程中宿主反应的动态图谱。
研 究 方 法
本研究从963名COVID-19患者住院期间(中位数：14 天，IQR 10-20)收集到血液样本，进行临床实验检测；随后通过靶向蛋白质组学和类固醇激素检测对部分样本进行了一系列分子和细胞研究，并描绘了疾病进展过程中循环因子和免疫细胞组成的变化；此外，本文比较了患者体内的支气管肺泡灌洗液(BALF)和外周血单核细胞(PBMC)样本的单细胞转录组及bulk转录组，以追踪异常循环细胞因子、趋化因子和其他分泌蛋白的来源。最后，基于转录组数据分析了基因调控网络的活动以及在 COVID-19感染阶段的PBMC中选择性剪接(AS)的影响。
临床检测全面分析COVID-19宿主反应的动态
通过对患者在感染和康复阶段的临床实验指标进行全面分析发现，与对照组和轻度/中度患者相比，重度/危重患者的进展始于急性淋巴细胞减少症和肾损伤，随后是细胞因子的动态产生和中性粒细胞水平升高、凝血、肾损伤和心脏衰竭等症状。大多数宿主反应会随着时间的推移而消退，但在某些从严重/危急情况中恢复的病例中，贫血和凝血异常持续存在(图 1b)。此外，本研究发现重度/危重患者中的死亡病例中，大多数常规血液参数和免疫细胞计数和比率的异常通常比存活的重度/危重病例更为明显。
图1 COVID-19中细胞因子和趋化因子的全面分析
患者血清中细胞因子和循环蛋白的分析
为了进一步分析新冠患者潜在的疾病机制，本文检测了新冠患者与对照组血清样本的细胞因子。结果发现先前普遍认为和淋巴细胞减少症相关的CRS涉及到的细胞因子(IL-6、GM-CSF、CXCL10等)在时间分布没有显示出关联性。反而是皮质醇(cortisol)的水平则与淋巴细胞计数呈负相关，并在后面的体外实验与动物模型中得到验证。因此推断皮质醇升高在淋巴细胞减少症中发挥重要作用。
图2 患者血清中细胞因子和趋化因子的全面分析
而关于患者血清中的循环蛋白，本文采用了靶向蛋白质组学进行了分析。结果发现，与对照相比，患者组中的循环蛋白显著增加，例如与心血管异常、免疫反应和炎症、器官损伤和凝血相关的蛋白，上升趋势与先前临床实验检测的结果一致。通过该结果确定了大量循环蛋白，并分析了它们在新冠患者血清中的动态变化，有助于帮助解析多种器官损伤、异常凝血和其他一些病理生理过程。
图3 患者血清中的靶向蛋白分析
重度/危重患者肺泡微环境中抗病毒免疫反应紊乱和异常细胞因子/趋化因子产生
为了探索先前研究中提到的细胞因子、趋化因子及分泌蛋白的来源，本研究进一步分析了患者和对照组的BALF和PBMC样本的RNA-seq数据。结果发现先前提到的大多数血清蛋白的mRNA在患者的BALF中的表达水平高于患者PBMC或健康BALF样本(图4 b)，这些结果表明与COVID-19严重程度相关的细胞因子，主要来自呼吸系统。
进一步单细胞测序分析发现，在BALF样本中，轻度/中度患者的T细胞显著增加(反应被激活)，但重度/危重患者和对照组之间基本没有差异(图4 d)，说明他们的T细胞反应受损。相比之下，重度/危重病例的特点是肺泡巨噬细胞和 T 细胞之间的CCL和 CXCL信号减弱，以及肺泡巨噬细胞自我激活增加(图4e)。通过富集分析发现，巨噬细胞中与趋化因子反应相关的基因在重度/危重病例中富集，而与抗原受体介导的信号通路相关的基因在轻/中度病例中被激活；在 T 细胞中，与中性粒细胞迁移相关的基因在重度/危重病例中富集，而与T细胞介导的细胞毒性相关的基因在轻度/中度病例中富集(图4 f)。
根据SARS-CoV-2相互作用蛋白的基因与BALF的bulk、single cell转录组数据发现，肺泡上皮细胞是主要的感染目标，在肺泡巨噬细胞中也发现了病毒-宿主相互作用蛋白(图4 h)。这些发现有助于分析支气管肺泡微环境中感染过程的宿主基因表达。
图4 严重/危重COVID-19患者BALF样本的转录组分析
感染和康复期间PBMC的宿主反应途径
一旦循环因子被释放到血流中，它们总是会对外周免疫细胞产生影响，从而引发全身宿主反应。通过对在样本组之间的差异基因表达分析发现，与对照组相比，患者在感染阶段与恢复阶段的上调基因均表明了体液免疫活跃反应。为了确定外周血中免疫细胞的情况，对新冠患者PBMC的scRNA-seq 数据进行了细胞相互作用分析，对照组和不同患者组之间的主要区别在于单核细胞和淋巴细胞之间的信号活动。如单核细胞和NK/CD8+T细胞中II 型IFN信号活性在轻度/中度高表达，但在重度/危重COVID-19中低表达，尤其是在晚期。相反，单核细胞中的自激活CCL和CXCL通路活性在严重/危重病例中高于轻度/中度病例或对照组样本。因此，CCL/CXCL信号参与肺泡巨噬细胞和外周单核细胞的过度激活，这两种细胞类型与淋巴细胞的通讯分别在肺和外周血中存在缺陷。
随后关于可变剪接(AS)的研究发现， 大量的AS事件在轻度/中度和重度/危重COVID-19之间存在显着差异。GO分析表明AS评分增加的基因与自噬、I 型IFN反应的调节和中性粒细胞脱颗粒显著相关。其中TP53的三种不同的剪接亚型在患者样本的AS评分中均显著降低，与TP53通路活性的增加呈负相关。
图5 患者的PBMC中的基因调控、可变剪接分析
总 结
本文使用了单细胞转录组结合多组学的综合分析，研究了COVID-19在发病后第一个月内主要表型特征的动态变化。结果表明，疾病恶化到严重/危急状态的最早指标是淋巴细胞减少和肾损伤标志物升高，这先于异常细胞因子释放和ARDS、凝血和心血管/肝损伤标志物升高。此外，研究发现患者血清中皮质醇异常增加是淋巴细胞减少症的可能原因之一，且皮质醇水平升高已被证明与重度/危重患者的死亡率相关。
基于bulk和单细胞水平的RNA-seq分析发现，重度/危重患者中无效的T细胞反应与肺泡巨噬细胞的过度自我激活以及肺泡巨噬细胞与 T 细胞之间的低CCL/CXCL信号传导有关，血液中单核细胞和T 细胞之间也存在类似的通讯减少。此外，COVID-19外周血的特征是多种信号通路活动，可揭示疾病的严重程度和阶段，这些通路大多与体液免疫的活跃反应相关。
