项目文章 | Tex13a通过其在mRNA降解中的潜在作用调控精子活力
发布时间：2021-11-03 19:29:28
10月18日，南通大学医学院生殖医学研究所孙斐教授团队采用新格元单细胞测序技术揭示Tex13a通过其在 mRNA 降解中的潜在作用调控精子活力。研究成果发表在《Frontiers in Cell and Developmental Biology ( IF 6.684 )》上，题为：“Tex13a Optimizes Sperm Motility via Its Potential Roles in mRNA Turnover”。文章采用 Tex13a-KO和 WT 组的睾丸，制备细胞悬液、捕获和文库制备（GEXSCOPE®单细胞转录组建库试剂盒），利用单细胞转录组测序监测睾丸细胞转录水平的变化。
据报道，在精子发生过程中，由于细胞核浓缩和转录终止，有数十个基因在圆形精子细胞中被大量转录，以便在精子细胞延长（ESs）的后期起作用。大多数已发表的论文与圆形精子细胞中的 piRNA、染色质体和无义介导的 mRNA 衰变 (NMD)相关。piRNA 在晚期精子细胞的mRNA 衰变中起重要作用。同样，据报道 CCR4-NOT 也参与了晚期精子细胞的 mRNA 降解。例如，睾丸中编码CCR4-NOT 复合物的核酸酶基因Cnot7敲除后导致生殖细胞缺陷和男性不育。CCR4-NOT 复合物是一种多功能机器，它包含两种不同类型的去腺苷酸酶，可有效缩短 mRNA 的 poly(A) 尾巴。然而，CCR4-NOT 复合物在调节 ESs 中作用仍然未知。
RNA的分解涉及三种类型的核酸酶和多种信号通路。这些核酸酶和通路通常在细胞中扮演冗余的角色。在这些途径中，CCR4-NOT 复合物可以有效降解 mRNA 的 poly(A) 尾部，并启动 mRNA 降解的早期和限速步骤。CCR4-NOT 复合体作为 poly(A) 尾的核心和非特异性剪刀，通常需要其他特殊“伙伴”的帮助，如 3'-UTR 调控元件和各种反式作用因子，才能触发靶向特定 mRNA 降解。Cnot1 是 CCR4-NOT 复合体的最大亚基，为其他亚基结合在一起提供了骨架。DND1 已被证明与 Cnot1 结合并介导精原细胞中特定 mRNA 的降解。
研究流程
scRNA-seq 文库按照 GEXSCOPE®单细胞转录组建库试剂盒（新格元，南京，中国）
研究结果
●Tex13a-KO引起延长精子细胞的 mRNA 延迟降解
为了研究Tex13a的功能，利用野生型 (WT) 和Tex13a敲除 (KO) 小鼠睾丸进行scRNA-seq。Marker基因注释到的细胞类型：一簇精原细胞、两簇精母细胞、一个精母细胞和早期精子细胞的混合细胞簇（Sd1）和九个单倍体精子细胞簇被划分（图S2A）。每个细胞簇的经典Marker在图 1A呈现。此外，通过分析WT和KO之间精子细胞（Sd5-Sd10）中后期的差异表达基因（DEGs），作者发现Sd10_WT和Sd10_KO具有更显着的DEGs，它们主要富集在蛋白酶、代谢过程和蛋白质翻译等途径（图S2B-D）。
图 S2 精细胞中的差异表达基因 (DEG)
文章还进行 CAMERA 富集分析来比较 Tex13a-KO 和 WT 小鼠之间每个基因集或信号通路的整体变化。C5（CC）通路基因集（GSEA）的CAMERA富集分析显示，参与精子尾部和头部结构成分的基因集显著上调（图1B）。C5 (MF) 和 C5 (BP) 通路基因集 (GSEA) 的 CAMERA 富集分析进一步表明 Sd10 ES 中转录组存在广泛改变（图 1C、D）。此外， 50 个标志性基因集富集分析显示，Sd10_KO 中各种看家基因的通路富集程度低于 Sd10_WT，这可能是由于“垃圾”mRNA 和看家基因转录本之间的竞争（图 1E）。大多数差异表达基因出现在Sd10中，也有一些出现在Sd9中，这与Sd9和Sd10中Tex13a的最高表达水平一致（图1F）。因此，Tex13a 可能参与了 ESs 晚期整体 RNA 代谢的调节。
图1 Tex13-KO 和 WT 小鼠延长精子细胞中基因表达的模式
● Tex13a是 CCR4-NOT 复合体的睾丸特异性成分
为了进一步验证 Tex13a 参与 RNA 代谢，作者分析了 Tex13a 与 CCR4-NOT 复合物的潜在关联程度，CCR4-NOT 复合物是参与 RNA 降解初始步骤的关键。在 CCR4-NOT 复合体的几个重要组成部分中，Cnot1 是最大和最主要的结构组成部分。如图 2A所示， Tex13a 难以通过蛋白质印迹或免疫荧光检测到 HA 标记的 Tex13a 在细胞系中的异源表达（数据未显示）。结果，从大肠杆菌中构建、表达和提取了在 N 端与 His6-HA 标签融合的全长 Tex13a 和与 GST 融合的五个重组片段。正如预期的那样，GST-pull down显示了 Tex13a 与 Cnot1有直接相互作用（图 2A、B），这种相互作用是由 Cnot1 的 C 端 HEAT 结构域（pfam 结构域 PF04054）介导的（图 2C）。作为反馈效应，Tex13a 缺失导致依赖去腺苷酸化的 mRNA 降解和 CCR4-NOT 途径的上调，但没有改变 RNA 降解途径的水平（图 2E）。作者基于 Tex13a 结合的共有 AGGUAA 基序以及 Tex13a 与 Cnot1 的相互作用，提出了一种新的 Tex13a 和 CCR4-NOT 复合物相互作用模型，这使 CCR4-NOT 复合物有可能在 ESs 的后期引起靶向 mRNA 降解（图 2F )。
图2 Tex13a 与 CCR4-NOT 复合体的关联
● Tex13a 缺失导致精子活力改变
文章发现精子结构成分RNAs的延迟降解可以改变精子活力的相关参数，如平均路径速度（average path velocity，VAP）（p = 0.01372）、平均曲线运动速度（curvilinear velocity，VCL）（p = 0.0009073）和快速运动率（p = 0.0001580）和精子浓度 ( p = 0.02968)（图 3）。与对照相比，Tex13-KO 小鼠精子的快速运动率发生显着改变。因此，推断快速运动率显着降低是Tex13a缺失的典型表型标记。
图 3 使用计算机辅助精子分析 (CASA) 系统分析精子活力
结论
本文确定了Tex13a是一种精子细胞特异性基因，它与 CCR4-NOT 复合物相互作用，并参与编码精子特定结构成分的 mRNA 的靶向降解。Tex13a 的缺失导致部分精子发生相关的mRNA 的延迟降解，可能是受限于精子细胞的mRNA储存空间的局限，导致很多看家基因的水平降低，并最终降低了与控制精子活力相关的几个关键参数，如平均路径速度、平均曲线运动速度和快速运动率。
参考文献
Li Yinchuan, Mi Panpan，et al., Tex13a optimizes sperm motility via Its potential roles in mRNA turnover. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 2021. https://doi.org/10.3389/fcell.2021.761627.
