I型糖尿病(Type 1 diabetes，T1D)是一种可由多因素导致的自身免疫性疾病，其主要病理特征是因自身免疫攻击胰腺β细胞而导致的高血糖。T1D好发于青少年（发病高峰年龄为6~15岁），且不同症状的出现不受年龄的限制。因其症状和并发症对青少年成长有较为严重的影响，T1D的发病机制与并发症的预防受到广泛重视。目前对T1D的遗传学、流行病学和临床管理已有广泛的认识，但对T1D患者骨髓细胞的变化了解仍然有限。已有越来越多的证据证实T1D与炎症和免疫细胞（如中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞和B淋巴细胞）密切有关，这些免疫细胞可以启动并促进T1D的病理进程。此外，外周免疫细胞比例的变化也与T1D引起的许多并发症有关，例如骨质减少和由骨质减少造成的骨折。然而，目前对T1D诱导骨质减少的机制没有明确的了解，也没有预防的标准指南。因此，揭示T1D诱导骨质减少的机制研究是迫切需要的，这将有利于降低T1D患者骨质减少和骨折的风险，从而提高T1D患者的生活质量。中性粒细胞和淋巴细胞是参与各种免疫反应中不可或缺的，中性粒细胞-淋巴细胞比值(NLR)升高已被广泛作为炎症和疾病的标志物。目前，已有研究表明T1D患者均有骨密度降低和外周血NLR升高的表现。骨髓作为产生免疫细胞的最初器官，其在T1D发生发展中的作用并没有得到足够的重视，尤其对于T1D骨髓中细胞种类的变化以及与骨质减少的相关性仍然知之甚少。本研究旨在通过单细胞RNA测序技术，揭示STZ诱导的T1D小鼠骨髓细胞的图谱，并揭示其骨髓和骨质减少的关系。

本研究使用新格元GEXSCOPE^®单细胞测序技术完成研究，采集健康(C组)和STZ诱导的T1D小鼠(D组)股骨和胫骨的全骨髓细胞，构建scRNA-seq文库从而进行单细胞RNA测序分析。重点关注比例变化最显著的BM-中性粒细胞和B淋巴细胞，并分析其在STZ诱导的T1D中的作用。此外，还通过单细胞流式细胞术检测骨髓中性粒细胞(BM-中性粒细胞)和B淋巴细胞的比例变化，并分析STZ诱导的T1D小鼠BM-中性粒细胞/B淋巴细胞比值与骨质减少的相关性。

图文摘要

1. 健康小鼠和STZ诱导的T1D小鼠的骨髓细胞图谱

作者从健康小鼠(C组)和STZ诱导的T1D小鼠(D组)的股骨和胫骨中收集了整个骨髓细胞。经消化和去红细胞处理后，C组收集12279个细胞，D组收集15118个细胞，分别进行单细胞RNA-seq分析(图1A)。图1B显示了C组和D组所有细胞的聚类UMAP图。C组和D组细胞均被分为12个细胞类型，包括中性粒细胞(主要表达Cxcr2、Ly6g、Ltf)、单核细胞(主要表达Fn1、Ccr2、F13a1)、中性粒细胞髓系祖细胞(NMP，主要表达Elane、Mpo、Prtn3)、T淋巴细胞(主要表达Cd3d、Ccl5、Ms4a4b)、B淋巴细胞(主要表达Cd79a、Cd19、Ighm)、树突状细胞(DC，主要表达Siglech、Irf8、Bst2)、红细胞(主要表达Hba-a1、Hbb-bs、Hbb-bt)、造血干细胞(HSC，主要表达Cd34、Adgrg1、Cdk6)、巨噬细胞(主要表达C1qa1、Vcam1、Mrc1)、嗜碱性粒细胞(主要表达Cd200r3、Mcpt8、Prss34)、浆细胞(主要表达Jchain、Iglc、Mzb1)和间充质干细胞(MSC，主要表达Cxcl12、Col1a2、Lepr)(图1C、D、G、H)。CD45在所有免疫细胞中表达，单细胞测序结果中CD45⁺免疫细胞在C组中占95.44%，D组中占96.33%(图1F)，这与流式细胞术的结果相符。在上述所有免疫细胞中，骨髓中性粒细胞比例增加最显著，B淋巴细胞比例下降最显著(图1E、F)。

图1.健康和STZ诱导的T1D小鼠的骨髓细胞图谱

2.STZ诱导的T1D小鼠骨髓中BM-中性粒细胞的异质性

为了探究BM-中性粒细胞的异质性，分析了BM-中性粒细胞亚群的特征。结果显示，BM-中性粒细胞可细分为6个亚群(图2A-C)：BM-neutrophil_1(主要表达Asprv1、Prok2和Fbxl5)、BM-neutrophil_2(主要表达Ltf、Zmpste24和Cybb)、BM-neutrophil_3(主要表达Clec4d、Thbs1和Egr1)、BM-neutrophil_4(主要表达Ube2c、Mki67和Top2a)、BM-neutrophil_5(主要表达Pcna、Rrm2和Pclaf)和BM-neutrophil_6(主要表达Actb、CT010467.1、Tmsb4x)(图2B、F)。与C组相比，D组中BM-neutrophil_1的比例增加最为显著，而BM-neutrophil_3的比例下降最为显著(图2D)。此外，免疫组化染色验证了D组BM-中性粒细胞(CXCR2⁺)的增加(图2 E)。在6个中性粒细胞亚群的所有基因中，Asprv1、Ltf、Clec4d、Ube2c、Pcna和Actb的变化最为显著。Asprv1和Clec4d在BM-neutrophil_1和BM-neutrophil_3中的变化最为显著(图2E)。Ltf和Actb在全骨髓细胞和6个BM-中性粒细胞亚群中表达(图2E)。Ube2c和Pcna分别主要在BMneutrophil_4和BM-neutrophil_5中表达(图2F)。

图2.C组和D组间BM-中性粒细胞的特征

对6个BM-中性粒细胞亚群进行了拟时序分析。结果表明存在两种不同的细胞分化轨迹，一种从BM-neutrophil_4和BM-neutrophil_5开始，向BM-neutrophil_1或BM-neutrophil_3分化，另一种从BM-neutrophil_2和BM-neutrophil_6开始，向BM-neutrophil_1或BM-neutrophil_3分化（图 3A-D）。同时latent time和RNA速率分析也证明了以上分化轨迹（图 3E）。由于D组细胞中BM-neutrophil 1所占比例最高，因此对BM-neutrophil 1中上调的DEGs进行GO富集和KEGG通路分析。结果表明，BM-neutrophil 1的DEGs中富集的生物过程大部分与代谢、葡萄糖代谢、合成代谢和细胞运动信号通路有关。细胞组成主要是细胞外囊泡，包括外泌体和其他细胞器(图3G)。KEGG通路分析表明，破骨细胞分化、IL-17信号通路和TNF信号通路是DEGs中高度富集的信号通路(图3H)。如图3I-J所示，上调最多的前5位基因是Asprv1、Pim1、Cebpb、H1f0和Prok2，下调最多的前5位基因是Lyz2、Ifitm3、Thbs1、s100a8和Lcn2。

图3.BM-中性粒细胞亚群的差异轨迹和DEG的富集

3.STZ诱导的T1D小鼠骨髓中B淋巴细胞的异质性

作者还研究了B淋巴细胞的特征和分化情况。B淋巴细胞的常见标记基因是Bank1、CD83和Ighd(图4F)。B淋巴细胞可分为两个亚群，前体B细胞(Pre B)和Naive B细胞。它们的UMAP图如图4A-C所示。观察到Pre B在C组中占主导地位，而D组中只存在Naive B(图4D)。免疫组化证实，D组的B淋巴细胞数量（CD79a⁺）减少（图4E）。此外，latent time和RNA速率分析显示，Pre B细胞亚型的产生早于Naive B细胞亚型(图4G)。对B淋巴细胞中上调的DEGs进行GO富集和KEGG通路分析。GO富集分析表明，大多数富集的生物过程与MHCII类肽抗原加工和呈递以及淋巴细胞增殖有关。富集的细胞成分主要包括MHC蛋白复合物、晚期核内体和溶酶体。主要的分子功能是MHC蛋白复合物的结合(图4H)。KEGG通路分析显示，DEGs主要富集于免疫相关疾病，包括结核病和哮喘、抗原加工和呈递以及造血细胞谱系(图4I)。两组DEGs如图4J和K所示，上调最显著的5个基因分别为H2-Aa、Ighd、Macf1、Ptpn22和H2-Eb1；下调最显著的5个基因分别为Vpreb3、Top2a、Mki67、Akap12和Myb。

图4.C组和D组间B淋巴细胞的特征

4.STZ诱导的T1D小鼠骨髓中单核细胞、T淋巴细胞和树突状细胞的异质性

之后作者分别分析了单核细胞、T淋巴细胞和树突状细胞的变化（如图5所示）。单核细胞分为5个亚型，包括经典单核细胞(主要表达Fn1、Tmsb10和Crip1)、中性粒细胞(主要表达Retnlg、Ngp和Camp)、NMP(主要表达Mpo、Prtn3和Ncl)、非经典单核细胞(主要表达Ace、Cd36和Apoe)和巨噬细胞(主要表达Cd74、H2-Aa和H2-Ab1)(图5A、D)。这些子集的UMAP如图5A-B所示。各亚群的比例变化与C组相比，除巨噬细胞亚群明显下降外，其他亚群的比例没有明显变化(图5C)。T淋巴细胞在T1D的发病机制中起重要作用。因此，接下来作者分析了STZ诱导的T1D小鼠骨髓中T淋巴细胞的亚群。T淋巴细胞被分成4个亚群，包括自然杀伤T细胞(NKT，表达Ly6c2、Ccl5和Cd69)，Naive T细胞/中央记忆T细胞(主要表达Ccr7、Hbb-bs和Gm14085)，自然杀伤细胞(NK，主要表达Gzma、Klra8和Klra4)，和CD4⁺T细胞(CD4⁺T，主要表达Rora、Ikzf2和Ttn)(图5E，H)。这些细胞亚型的UMAP如图5E-F所示。各亚群的比例变化中D组除Naive T细胞的比例明显增加外，其他T细胞亚群的比例均呈下降趋势(图5G)。树突状细胞细分为4个亚型，分别为DCs_1(主要表达Klk1、Cd74和H2-Aa)，DCs_2(主要表达Stat1、Runx2和Ly6d)，DCs_3(主要表达Top2、Mki67和Hist1h1b)和DCs_4(主要表达Prtn3、F13a1和Mcm3)(图5I，L)。这些亚型的UMAP如图5I-J所示。各亚型的比例变化除DCs_1的比例显著下降外，D组其他DC亚型的细胞比例略有增加(图5K)。

图5.C组和D组间单核细胞、T淋巴细胞和树突状细胞的特征

5.STZ诱导的T1D小鼠的骨质减少

为了确定STZ诱导的T1D小鼠是否发生骨质减少，作者使用X线和micro-CT分析C组（28w，n=6）和D组（28w，n=5）股骨与胫骨的骨量的变化。图6A为股骨和胫骨的X线图像，显示D组的骨密度明显低于C组。此外，股骨同一部位的micro-CT图像显示D组皮质骨明显变薄。骨密度（BMD，P < 0.001）、骨小梁体积/总体积（BV/TV）（P<0.001）和骨小梁厚度（Tb.Th）（P<0.001）也明显降低（图6C）。同时，骨小梁数(Tb.N)(P=0.098)和骨小梁间隙(Tb.Sp)（P=0.085）分别出现了下降和上升的趋势(图6C)。综上所述，STZ诱导的T1D小鼠发生骨质减少。

图6.STZ诱导的T1D小鼠发生骨质减少

6.STZ诱导的T1D小鼠骨髓中免疫细胞的比值

图7A结果表明，该实验T1D模型是成功的。C组和D组之间的免疫细胞比例如图7B所示。用RD/RC(D组/C组细胞比例)来说明C组和D组之间的差异。从图7C中可以看出，BM-neutrophil_1/Naive_B的RD/RC最高。BM-中性粒细胞/树突状细胞、BM-中性粒细胞/B淋巴细胞、单核细胞/树突状细胞和单核细胞/B淋巴细胞的RD/RC均呈增加趋势。以上结果发现，骨髓中BM-中性粒细胞/B淋巴细胞的比例增加，与外周血中的中性粒细胞与淋巴细胞比值增加相符。

图7.STZ诱导的T1D小鼠的鉴定及C、D组间免疫细胞的比例

7.骨髓中骨髓-中性粒细胞和骨髓B淋巴细胞的比值升高与STZ诱导的T1D小鼠骨质减少相关性分析

接下来，采用单细胞流式细胞术验证C组(左，n=4)和D组(右，n=4)中BM-中性粒细胞(Cxcr2⁺，Ly6g⁺)和B淋巴细胞(Cd19⁺)的比例变化(图8A)。BM-中性粒细胞/B淋巴细胞的比值(P=0.040)如图8B所示。结果表明，BM-中性粒细胞/B淋巴细胞比值与BV/TV比值呈负相关(r=-0.7619，P=0.0368)(图8C)。

图8.免疫细胞与骨质减少的相关性

该研究首次通过GEXSCOPE^®单细胞RNA文库试剂盒(Singleron Biotechnologies)构建scRNA-seq文库进行单细胞RNA测序分析，客观地揭示了STZ诱导的T1D小鼠的骨髓细胞图谱，明确了BM-中性粒细胞、B淋巴细胞、单核细胞、T淋巴细胞和树突状细胞的特征。作者进一步探讨了STZ诱导的T1D小鼠骨髓免疫细胞与骨质减少之间的关系。发现BM-中性粒细胞比例增加最显著，而B淋巴细胞比例下降最显著，并通过单细胞流式细胞术证实。作者发现在STZ诱导的T1D小鼠中，BM-中性粒细胞/B淋巴细胞比例的增加与骨质减少呈负相关，这可能是血液中外周血NLR增加的原因。同时，GO和KEGG分析显示，BM-中性粒细胞和B淋巴细胞可能参与了T1D和T1D诱导的骨质减少的发病机制。提示今后可以对BM-中性粒细胞和B淋巴细胞进行深入的研究，以加强对T1D和T1D诱导的骨质减少机制的理解。这项研究表明，精确调控骨髓中的免疫细胞可能成为治疗T1D和预防T1D诱导的骨质减少的新策略。

[1] J. Zhong, X. Mao, H. Li et al., Single-cell RNA sequencing analysis reveals the relationship of bone marrow and osteopenia in STZ induced type 1 diabetic mice, Journal of Advanced Research, https://doi.org/10.1016/j.jare.2022.01.006