肾移植是目前治疗终末期肾病最有效的方法。然而，慢性抗体介导的排斥反应（cABMR）仍然是肾移植患者长期生存的严重障碍，是一个有待解决的问题。目前，T细胞和B细胞亚群等免疫因子在肾移植后cABMR中的作用和机制尚不清楚。本研究期望通过单细胞测序对cABMR发病机制进行全面的解析。

本研究中，对cABMR和对照受试者的外周血单核细胞（PBMC）进行scRNA-seq，以在单细胞分辨率下分析转录组学景观。结果表明，cABMR患者的大多数细胞类型释放干扰素反应和促炎细胞因子，T细胞和B细胞中MTND6、CXCL8、NFKBIA、NFKBIZ等表达上调，这些基因与促炎症反应和免疫调节有关。Western blot和qRT-PCR实验也证实这些基因在cABMR中表达上调。GO和KEGG富集分析表明，T细胞和B细胞中高表达的基因主要富集在炎症途径中，例如TNF、IL-17和Toll样受体信号通路。此外，MAPK和NF-kB信号通路也参与了cABMR的发生发展，与western blot的实验结果一致。拟时轨迹分析显示T细胞亚群具有三条独特的转录分化路径，细胞相互作用分析显示cABMR中有较强的T/B细胞和中性粒细胞激活。该研究为cABMR的发病机制提供了新的见解，同时对确定新的治疗靶点具有指导意义。

1、cABMR患者免疫细胞亚群组成

scRNA-seq数据中细胞降维聚类结果显示10种主要的细胞类型，分别为T细胞、B细胞、NK细胞、经典单核细胞、非经典单核细胞、树突状细胞、嗜碱性粒细胞、血小板、中性粒细胞祖细胞和中性粒细胞，本结果明确了肾移植后患者外周血细胞群的组成。

图1 cABMR患者与对照组免疫细胞亚群组成

2、cABMR患者T细胞亚群的免疫学特征

为了分析cABMR患者T细胞亚群表达的变化，对T细胞进行亚群细分显示具有四种，分别为：CD8粘膜相关T细胞、gd T细胞、CD8效应T细胞和初级T细胞/中央记忆T细胞。

图2 T细胞亚群细分相关结果

cABMR组中gd T细胞、CD8效应T细胞和CD8_MAI T细胞中的DEG表达上调，包括MT-ND6、CXCL8、S100A9等。线粒体基因MT-ND6在排斥反应中的作用和机制尚未见报道，MT-ND6表达上调可能与线粒体氧化应激有关。CXCL8和S100A9参与中性粒细胞的激活，它们还参与NF-kB信号通路的激活，NF-kB在炎症和肿瘤中已被广泛研究，但其在抗体介导的排斥反应中的作用尚不清楚。CXCR4通过与CXCL12结合并激活各种下游信号通路，促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，一些关于CXCR4在免疫排斥反应中作用的研究表明，其拮抗剂可以有效降低移植后排斥反应的强度，观察结果与我们的结果一致。GO和KEGG富集分析证实NF-kB和MAPK信号通路均参与T细胞激活和抗体介导的排斥反应；这可能与NF-kB和MAPK信号通路介导的炎症反应有关，它们对免疫细胞的调节作用有待于进一步研究证实。

图3 T细胞亚群功能富集结果展示

进一步研究T细胞亚群的分化轨迹，共获得三条路线轨迹。与对照组相比，cABMR组显示出完全不同的分化轨迹，表明cABMR中T细胞亚群的分化途径并不一致。为了比较T细胞亚群的差异，根据之前定义的四个亚群对每个亚群进行轨迹分析。CD8效应T细胞和gd T细胞显示出三种不同的分化轨迹，而CD8效应T细胞和原始T细胞主要有两种分化轨迹。此外，还评估了差异表达基因的时间模拟轨迹的变化，总共获得了4个差异表达基因簇，例如在簇1中，共有15个差异表达基因最显著的DEG（包括MT-ND6、CXCL8、CD69和PAXBP1）被富集，这与GO和KEGG富集分析的结果一致。

图4 T细胞亚群的拟时轨迹分析结果展示

在T细胞和B细胞的转录组分析中，使用GO和KEGG富集分析发现T细胞、B细胞和中性粒细胞的持续激活。这些结果表明，细胞间的相互作用可能参与了cABMR的发生和发展。因此，研究细胞间通讯和信号网络的相互作用可能为发现cABMR的新治疗靶点提供新的见解。图5显示了不同类型免疫细胞中受体和配体之间的潜在相互作用。例如CD8 MAIT细胞、CD8效应T细胞和gd T细胞之间的相互作用最强，趋化因子途径分析显示CCL5-CCR5信号轴在gd T细胞与CD8 MAIT细胞、CD8效应T细胞与CD8 MAIT细胞内最强。gd T细胞通过CD94:NKG2A/C-HLA-E信号轴激活其他亚群。因此，gd T细胞可能参与cABMR的发病机制，并通过激活CD8⁺T细胞诱导其他细胞的损伤。