项目文章 | 单细胞RNA测序揭示糖尿病周围神经病变机械性痛觉超敏的发生机制

发布时间：2022-06-02 13:22:01  

5月20日，上海交通大学医学院附属第九人民医院神经外科张文川教授团队采用新格元单细胞转录组测序技术揭示了糖尿病周围神经病变机械性痛觉超敏的发生机制。该研究结果发表在《Frontiers in Molecular Neuroscience》期刊上，题为“The Development of Mechanical Allodynia in Diabetic Rats Revealed by Single-Cell RNA-Seq”。

研究背景

糖尿病人的“痛”

DPN(diabetic peripheral neuropathy)即糖尿病周围神经病变。DPN是糖尿病并发症的一种，在糖尿病患者中患病率接近50%。其中痛性糖尿病周围神经病变(Painful DPN)患者在临床上可能出现慢性疼痛，诱发足部溃疡、步态障碍，最终导致下肢截肢，严重影响患者生活质量。

糖尿病周围神经病变的发病机制尚不清楚，目前主要认为与高血糖、脂代谢紊乱和胰岛素信号通路异常所导致的病理生理变化相关。本篇论文在单细胞水平上比较机械性疼痛超敏阳性和阴性的糖尿病周围神经病变大鼠的细胞变化，鉴定出一类新的神经元细胞类型，为揭示糖尿病周围神经病变机械性痛觉超敏的发生机制作出重要贡献。

研究方法

1、在SD大鼠中注射链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)，3天后血糖浓度超过11.1mmol/l判定为糖尿病大鼠模型；

2、疼痛学行为检查：注射STZ的28天后，对糖尿病大鼠使用不同的力刺激大鼠后爪，通过划分指标PWT(paw withdrawal threshold)将PWT小于等于8g力即有反应的糖尿病大鼠划分为机械性痛觉超敏反应(MA，Mechanical Allodynia)阳性糖尿病大鼠，PWT大于等于15g力划分为机械性痛觉超敏反应阴性糖尿病大鼠。正常对照大鼠PWT均大于等于15g力；

分析思路

研究结果

1、大鼠背根神经节细胞图谱构建

为研究有无机械性痛觉超敏糖尿病大鼠的细胞和基因表达变化，对8只大鼠（2只对照、4只MA阳性糖尿病大鼠和2只MA阴性糖尿病大鼠）的背根神经节进行scRNA-seq，质控后获取6693个细胞，共注释出8个主要细胞类型。包括神经元细胞、小胶质细胞、卫星胶质细胞、增殖性卫星胶质细胞、施旺细胞、成纤维细胞、血管平滑肌细胞和血管内皮细胞。对神经元细胞进行无监督聚类获得11个cluster。

2、与机械性痛觉超敏相关的新型神经元细胞鉴定

对神经元细胞进行亚型细分注释，共注释出肽能伤害感受器（PEP）、非肽能伤害感受器（NP）神经元、生长抑素阳性神经元、C-纤维低阈值机械受体神经元和鉴定出与MA相关的新型神经元细胞-MAAC神经元（蓝紫色）。MAAC神经元细胞占比在正常对照大鼠、无MA糖尿病大鼠和有MA糖尿病大鼠中呈递增趋势（分别为0.28%，2.46%，4.21%）。

3、MAAC神经元特异表达基因鉴定

为研究MAAC神经元的基因表达特性，鉴定出上百种MAAC与其它神经元细胞差异表达基因。其中基因Fxyd7（以及同源基因Fxyd1）和Atp1b1（以及同源基因Atp2b4）均在MAAC中高表达，且Fxyd7和Atp1b1均是与NA,K-ATP酶相关基因。

对MAAC的差异基因进行GO富集分析表明，这些差异基因主要富集在神经丝束组装、受体内化、细胞形状调节等生物学过程。

4、MAAC神经元的起源和分化

MAAC神经元细胞的基因表达特性与肽能伤害感受器（PEP）神经元细胞相似，且MAAC神经元与PEP神经元在神经元细胞UMAP图上距离上毗邻。对PEP神经元和MAAC神经元进行拟时间轨迹分析，假定PEP神经元处于分化的根，MAAC处于分化的叶。

根据PEP向MAAC分化的过程中的基因分为4个基因集，第一和第二个基因集在分化过程中表达上调，GO富集分析表明上调的基因集与细胞形态建成、细胞粘附和神经元发育相关；第三和第四基因集在分化过程中表达下调，GO富集分析表明下调的基因与炎症反应、疼痛感知等相关。

5、神经元细胞亚型转录因子调控网络分析

为分析哪些转录因子对MAAC的细胞构成起关键作用，对包括MAAC在内的神经元细胞亚型进行TF调控网络分析，发现Hoxb7与Larp1是参与MAAC细胞构成比较重要的转录因子，且Hoxb7与Larp1在MAAC中有较高的基因表达。

进一步分析表明，转录因子Hoxb7调控大部分MAAC中差异表达的基因如Atp1b1（NA,K-ATP酶相关基因）和S100b等，而Larp1仅调控MAAC差异基因中的Gap43和Arid5b。由此表明转录因子Hoxb7相对Larp1是MAAC最重要的转录因子。

6、MAAC与其它细胞的细胞通讯特性

将MAAC与其它神经元细胞亚型与小胶质细胞、卫星胶质细胞等进行细胞通讯分析。结果表明MAAC与其它神经元细胞亚型几乎不存在细胞互作，与卫星胶质细胞和增殖性卫星胶质细胞存在明显的细胞互作，且互作强度较强。

配受体对分析表明，MAAC与卫星胶质细胞和增殖性卫星胶质细胞可能通过Ptn-Sdc4,Ptn-Ptprz1,Ptn-Ncl,Bdnf-Ntrk2进行互作，MAAC与血管平滑肌细胞和小胶质细胞可能通过Ptn-Ncl进行互作，MAAC与血管内皮细胞可能通过Calcb-Calcrl, Calca-Calcrl进行互作，结果表明MAAC作为信号靶标时Ncl起到比较重要的作用，而且SGC可能通过Ptn-Ncl和Mdk-Ncl介导PDSN大鼠MAAC神经元细胞的轴突异常生长。

研究结果

本研究对正常大鼠、MA阳性糖尿病大鼠和MA阴性糖尿病大鼠进行scRNA-seq，发现糖尿病大鼠中MAAC细胞大鼠细胞占比存在明显提升。接着分析MAAC中的差异表达基因，发现MAAC高表达与NA,K-ATP酶相关基因。轨迹分析表明MAAC可能有肽能伤害感受器神经元发育而来并鉴定出MAAC中最重要的转录因子Hoxb7。最后通过细胞通讯分析表明MAAC与神经胶质细胞存在较强的细胞互作。

参考文献

Zhou H, Yang X S, Liao C L,et al. The Development of Mechanical Allodynia in Diabetic Rats Revealed by Single-Cell RNA-Seq. Frontiers in Molecular Neuroscience.2022 May 20. doi.org/10.3389/fnmol.2022.856299