作者首先利用单细胞转录组构建了RP发生组和对照组小鼠肺和PBMC的细胞图谱。然后从分析上层层剖析，分析两组间各类细胞，包括：上皮细胞、肺泡细胞、成纤维、内皮细胞、T细胞和巨噬细胞等的不同转录特征，进一步挖掘不同细胞亚群间的通路功能、转录调控机制和细胞转移演化关系，最后还从细胞互作的层面揭示了RP发生的细胞微环境网络。

1、放射性肺炎(RP)小鼠单细胞转录谱

首先作者利用4个样本共43062个细胞构建了小鼠肺组织和PBMC细胞图谱，将细胞分为上皮细胞、免疫细胞、内皮细胞或基质细胞4大类，又可细分为15个细胞亚群。其中在PBMC样品中，T细胞和B细胞占很大比例，肺炎组织标本中T细胞浸润略低(图2)。

图2 放射性肺炎(RP)小鼠单细胞转录谱

2、RP肺组织和对照上皮细胞亚群的转录特征

作者进一步分析了上皮细胞(1511个AT2和300 club细胞)，亚群细分为8个cluster。作者发现辐照后AT2和club细胞均减少, AT2中有346个基因在照射后表达发生改变，其中178个基因表达下调，168个基因表达上调，其中很多是线粒体基因，GO、KEGG和GSVA分析表明了放疗诱导肺组织氧化应激，上调线粒体去极化相关的大量线粒体基因，可能激活cGAS-STING信号通路(图3)。

图3 上皮细胞转录谱及上皮细胞发育轨迹

3、成纤维细胞和血管内皮细胞标志物及通路分析

作者对成纤维细胞和血管内皮细胞进行了分析，共鉴定出349个成纤维细胞， RP纤维母细胞基因表达谱显示280个基因表达降低，326个基因表达升高。对这些基因的GO和KEGG富集分析显示：生长因子结合、纤维组织、黏附灶、细胞外基质(ECM)、WNT信号通路、氧结合和血红蛋白在RP成纤维细胞中富集，可能促使RP降低血红素以响应ROS。另外，作者在肺组织样本中鉴定了288个血管内皮细胞(VECs)，高表达免疫球蛋白超家族Icam-1，一种细胞间粘附分子和炎症介质，表明RP VECs在蛋白加工、免疫应答、氧化磷酸化信号通路和细胞增殖方面发挥重要作用(图4)。

图4  RP中成纤维细胞和血管内皮细胞功能的变化

4、肺组织和PBMC的T细胞亚群有显著差异

下一步分析显示，RP组肺组织中T细胞的比例略有下降，这些T细胞可以进一步分为五种亚型。照射组对比对照肺组织T细胞亚型，对照组CD8⁺ T细胞含量明显降低，而效应T细胞水平升高3倍以上，可能是炎症状态诱导CD8⁺ T细胞功能激活所致。富集分析也提示这些T细胞亚型均处于激活状态，CD4⁺ naive T细胞、CD8⁺ naive T细胞和CD8⁺效应T细胞中核糖体相关通路的基因也高度表达，提示有活性的蛋白合成，这可能与这些T细胞亚型的免疫功能有关。Monocle2分析还揭示了T细胞中的动态免疫状态和细胞转变，发现幼稚T细胞主要分布在轨迹路径的早期状态中，而Treg细胞和增殖性T细胞大多处于终末状态,证明了T细胞状态从幼稚到激活的转变。

接下来，作者利用SCENIC(单细胞调控网络推断和聚类)技术从RP样本中发现T细胞中的活性转录因子和顺式调控元件，并确定了T细胞中的61个区域和一些转录因子在所有T细胞亚型中富集，包括LEF1、JUNB、JUN和FOS。此外，在naïve CD4⁺ T和CD8⁺ T细胞中，TCF7和FOXP1被激活(图5)。

图5 T细胞图谱和轨迹分析

对5173个巨噬细胞的重新聚类发现了11个不同的聚类，每个聚类表现出特定的转录组模式。在这些Fcn1-巨噬细胞中，C1和C2簇在RP小鼠中有明显的扩张，均表现为Fabp4^low和Spp1^high特征。相比之下，唯一的RP小鼠中Fabp4^high cluster C4几乎被消除。此外，还有4个Spp1^low Fabp4-簇(C3, C5, C9, C10)高表达C1qc，与调节免疫细胞功能密切相关。C4巨噬细胞可能在正常肺功能中发挥基本作用(图6)。

图6 巨噬细胞的单细胞转录谱

5、RP小鼠B细胞在组织中有连续变化

作者还分析了B细胞的亚群，共鉴定出8种B细胞亚型，包括3种已知亚型：浆细胞(C4)、naive B细胞(C6)和干扰素刺激基因(ISGs)-B细胞(C8)。值得注意的是，浆细胞主要存在于组织样本中，而血液样本中不存在浆细胞。与对照组相比，RP组C1、C5、C7亚组的比值显著升高。拟时序轨迹分析提示浆细胞位于B细胞发育分化的末端，符合B细胞分化的特点。此外，与对照组相比，肺炎标本的B细胞在不同状态下分布更连续，后者只位于单一状态。这可能与RP肺组织中更多样化的B细胞亚型组成有关，表明来自肺炎样本的细胞之间的过渡状态有更强的关系(图7)。

图7  B细胞的转录图谱和轨迹分析

6、RP小鼠更复杂的细胞-细胞相互作用

最后，作者试图识别RP肺组织中潜在的细胞串扰。发现巨噬细胞、混合淋巴细胞、NK细胞和中性粒细胞在细胞-细胞间的通信网络中占主导地位，这表明这些细胞在RP发育中起着重要作用，且其在对照肺组织中是不活跃的。此外，成纤维细胞还能分泌MIF(迁移抑制因子)、GRN、CCL11、FAM3C、靶向CD74、TNFRSF1B、CCR2、 FFAR2和LAMP1分别作用于巨噬细胞。其中，MIF是一种多功能促炎因子，通过分泌靶向单核细胞、中性粒细胞、VECs和AT2的TNF，调节先天免疫，促进巨噬细胞活化，形成正反馈回路(图8)。

图8 RP小鼠更复杂的细胞-细胞相互作用