1 瘢痕疙瘩的细胞图谱景观

从12名患者的瘢痕疙瘩皮肤组织(Keloid/K组)与配对的邻近正常组织(Normal/N组)中获得427,171个细胞(Keloid组：213,105，Normal组：214,066)，根据聚类和marker基因将所有细胞分成11种主要细胞类型：角质形成细胞谱系、内皮细胞、成纤维细胞、汗腺细胞、壁细胞、朗格汉斯细胞、单核吞噬细胞、肥大细胞、黑色素细胞、施万细胞和T细胞。其中，角质形成细胞谱系、内皮细胞、成纤维细胞是组织中占比最高的三种细胞类型。通过对比两组的分组展示降维图、细胞占比柱状图，发现瘢痕疙瘩中成纤维细胞、内皮细胞、肥大细胞、壁细胞和施万细胞明显增加。

图1 瘢痕疙瘩的整体细胞图谱景观

2 瘢痕疙瘩的间充质成纤维细胞亚型明显增多

瘢痕疙瘩中的成纤维细胞一直被认为是其生长增殖的主要原因。为了确定增生的具体细胞亚型、探究其在纤维化发病机制中的作用，对成纤维细胞进行了无监督聚类并根据文献中正常皮肤成纤维细胞亚型注释，分成分泌乳头状(SPF)、分泌网状(SRF)、间充质(MF)和促炎(PF)。结果发现与正常组织相比，瘢痕疙瘩中MF的比例明显增加，而SPF和SRF降低。

进一步探索亚群的高表达基因发现，与基质合成、成纤维细胞和成骨细胞分化相关的基因(包括ASPN、POSTN、CTHRC1、FN1和COL11A1)、分泌蛋白(如SPARC、SFRP4、COMP、COL11A1和COL12A1)在间充质亚群中明显富集。更有意思的是，组间对比显示，与正常皮肤相比，这些细胞外基质形成基因(COL1A1、COL3A1、POSTN、COL1A2、FN1和ASPN)在瘢痕疙瘩中也是显著上调的。进一步的功能富集分析表明，血管生成、蛋白质分泌、上皮间质转化和PI3K/AKT通路在瘢痕疙瘩的所有成纤维细胞类型中均明显富集。

图2 瘢痕疙瘩中成纤维细胞的特征

3.1 瘢痕疙瘩中M2巨噬细胞增多并表现出肿瘤相关巨噬细胞的特征

主要细胞类型注释结果显示，瘢痕疙瘩和邻近正常组织之间的免疫特征也存在明显差异，尤其是单核吞噬细胞(MPs)。紧接着作者进行了MPs的亚型细分。结果显示，瘢痕疙瘩中的巨噬细胞明显富集，而cDC2比例略有降低。免疫荧光结果也证实了这些细胞类型在瘢痕疙瘩中的变化。

此外，诸多研究表明，从创面愈合早期一直到瘢痕形成后期，巨噬细胞都起着重要的调节微环境的作用，对巨噬细胞进行亚型细分之后，获得两种细胞类型：M1型和M2型，降维图显示M2型在疾病组中明显增多。研究还发现，瘢痕疙瘩组中的巨噬细胞高表达线粒体氧化磷酸化过程相关基因(如MT-CO1、MT-CYB、MT-ND5、MT-CO3)、细胞外基质结合和形成相关基因(如COL1A1和SPARC)，而低表达细胞外基质代谢蛋白分解基因(如：MMP9)。为了探究其中是否存在肿瘤相关巨噬细胞，作者进行了Hotspot分析，研究得到了13个模块，其中Module2(高表达RNASE1、C1QA、CD163、CD14、C1QC、FCGRT和MS4A7)和Module10(高表达APOC1、CTSB、CTSL和TYROBP)可能表现出肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)的特征。

图3 瘢痕疙瘩中髓系细胞特征研究

3.2 瘢痕疙瘩中T细胞表现出干扰素反应、血管生成特征

鉴于T细胞在免疫中的重要作用，研究对T细胞进行了亚型细分，确定了六种细胞亚型，包括CD4⁺初始T细胞、CD4⁺效应记忆T细胞、CD8⁺效应T细胞、CD8⁺黏膜相关不变T细胞、CD4⁺调节性T细胞和增殖性T细胞，其中CD8⁺效应T细胞的比例在瘢痕疙瘩中略有增多，CD4⁺初始T细胞和增殖T细胞略有减少；而Augur分析表明增殖T细胞是组间差异最大的细胞类型。富集分析表明，两组之间的T细胞亚型在血管生成、肌生成、干扰素α反应和干扰素γ反应方面均存在明显差异。接着通过免疫组化验证了瘢痕疙瘩中CD8⁺和CD68⁺细胞增多、CD4⁺细胞减少、炎症因子iNOS、IL-10和IL-12表达升高的现象。

图4 瘢痕疙瘩中T细胞特征研究

4 瘢痕疙瘩组织中存在成纤维细胞、免疫细胞、内皮细胞的互作激活

为探究细胞之间的相互作用关系，作者使用CellPhoneDB分析了组织中细胞间通讯的差异，结果证明了瘢痕疙瘩和邻近正常组织之间存在明显不同的细胞通讯方式。研究发现，瘢痕疙瘩组织中，细胞类型间的相互作用要比正常组织强得多，尤其体现在成纤维细胞亚型、内皮细胞亚型、巨噬细胞之间。基于此，作者进一步研究了互作对及下游激活的转录因子，发现瘢痕疙瘩中的成纤维细胞可通过TGFB2-TGFBR2、TGFB3-TGFBR3、CCL2-CCR1和CCL2-CCR5与MPs发生特异性互作，激活MPs中的转录因子ATF4和RB1。由于RB1的下游基因与M2巨噬细胞标志物相关，例如：C1QC、C1QB、MRC1，因此，瘢痕疙瘩中的成纤维细胞可能有利于M2巨噬细胞的转移和增殖。以上结果说明，瘢痕疙瘩可能存在以巨噬细胞为中心的调控网络，而成纤维细胞可能促进M2巨噬细胞的转移和增殖。

图5 组间细胞通讯差异