前列腺外周区和移行区的细胞捕获及生信处理流程
本文构建了一个包含18,315个前列腺细胞图谱，来源于3例前列腺癌患者的良性前列腺(配对的PZ和TZ组织)，再进行scRNA-seq分析，并通过免疫荧光染色进行了结果验证。
项目文章 | 单细胞技术刻画老年前列腺外周区和移行区图谱
发布时间：2022-11-18 09:56:35
2022年10月，北京医院泌尿外科刘明主任团队通过单细胞转录组测序(scRNA-seq)建立了老年前列腺外周区(PZ)和移行区(TZ)的单细胞图谱，揭示了老年前列腺的PZ和TZ之间的异质性，这可能有助于了解前列腺疾病的空间分布特点，并为发现新的治疗靶点奠定基础。
下面和元小新一起来看下吧。
研究背景
前列腺(prostate)会随着年龄的增长而发生巨大变化，通常会在老年患者中引起疾病，良性前列腺增生(BPH)和前列腺癌(PCa)是老年患者常见的两种前列腺疾病。因此，进一步识别老年前列腺内的细胞和功能异质性对于了解前列腺疾病的空间分布和发生发展至关重要，这可能有助于确定新的治疗靶点。前列腺是一种异质性腺体，包含表型和功能多样化的细胞亚群。人类前列腺的组织学组成主要包括上皮细胞和纤维肌间质，在解剖学上可以将前列腺分为三个腺区：外周区(PZ)、中央区(CZ)和移行区(TZ)。
思维导图
研究方法
研究结果
1.老年前列腺单细胞图谱
单细胞数据质控之后，将18,315个单细胞分为13个簇(图1B)，并根据特异性基因标注为上皮细胞(EPCAM)、内皮细胞(CD200)和两种类型的成纤维细胞[炎性成纤维细胞(iFib:PDGFRA)和肌成纤维细胞(mFib:RGS5)]、白细胞(PTPRC)和浆细胞(MZB1)，值得注意的是，BPH治疗的靶点SRD5A2仅在iFib中表达(图1C)。随后，进一步将EPCAM+上皮细胞分为七个子簇(图1D)，并根据标记基因，结合正常年轻人前列腺的既往研究，将子簇2、3和5分别标注为基底细胞(KRT14)、hillock细胞(KR13)和club细胞(SCGB3A1)，子簇0、1、4和6标注为管腔细胞。所有高表达的管腔标记物(KLK3)均与先前发表的管腔上皮表型相关(图1E和F)。
Fig 1. 老年前列腺单细胞图谱
2.前列腺上皮细胞4种亚型的功能异质性和空间分布
接着，作者对上皮细胞亚型进行了GSVA分析，观察到基底细胞具有丰富的细胞外基质(ECM)功能，管腔细胞作为功能性分泌上皮细胞，与雄激素、蛋白质分泌和类固醇相关途径高度相关(图2A)。此外，与管腔细胞和基底细胞相比，hillock和club细胞中前列腺干细胞(例如PSCA和LY6D)和神经元(例如SOX2)相关基因高表达，而谱系基因(例如AR、KLK3和NKX3-1)在管腔细胞中有着更高水平的表达(图2B)。为了进一步确定四种上皮细胞亚型的特征，作者将数据与先前公布的转录组进行了关联分析，结果表明，Club和hillock细胞与去势抵抗性前列腺癌祖细胞(LSCmed cells)、正常前列腺干细胞(CFSE‐high cells)和小鼠管腔干细胞(luminal 2)高度相关，与神经内分泌前列腺癌干细胞(NEPC signature)略微相关，BPH相关信号在管腔细胞中富集(图2D)。接下来，作者对上皮细胞4个亚型进行了Monocle2拟时序分析，club和hillock细胞位于基底细胞和管腔细胞之间。值得注意的是，在club和hillock细胞中观察到大量未剪切的RNA(图2E、图2F)。
Fig 2. 前列腺上皮细胞4种亚型的功能异质性和空间分布
3.前列腺管腔细胞的功能异质性
从管腔上皮细胞的降维图上可以看出，cluster 1(TFF3+)主要分布在PZ中，而cluster 0(KLK3+)和cluster 4(IDH1+)细胞主要分布在TZ中(图3A)。免疫荧光证实，PZ比TZ含有更多的TFF3+细胞(图3B)。GSVA分析表明TFF3+管腔细胞具有较高的MYC(如ROCK1和NPM1)和E2F(如TFF3和NAP1L1)通路活性和基因表达，KLK3+管腔细胞具有较高的雄激素和蛋白质分泌功能活性和基因表达(如MSMB、ARG2和TMPRSS2)(图3C和D)。GSVA分析进一步证实，IDH1+和LTF+管腔细胞中具有club/hillock细胞特征(图3E)。基因调控网络分析表明，许多雄激素调节的调节子，如SPDEF和NKX3-1，在KLK3+管腔细胞中高度激活，而MYC和SOX4调节子在TFF3+管腔细胞中激活，club细胞相关调节子LTF在LTF+和IDH1+管腔细胞中激活(图3F)。
Fig 3. 前列腺管腔细胞的功能异质性
4.外周区和移行区之间的功能异质性
作者对TZ和PZ中的上皮细胞的功能进行了比较，发现TZ中所有上皮细胞的血管生成和炎症相关通路均被激活。有趣的是，NOTCH信号在TZ的club和hillock细胞中更活跃(图4A)。
与PZ相比，TZ中所有上皮细胞中的干性相关基因表达丰富，而AR和管腔相关基因在PZ上皮细胞中表达丰富(图4B)。一些重要的DNA修复基因(如MSH2、APRT和POLR2I)、MYC和E2F通路基因(如NPM1、RACK1和PRDX4)的表达在PZ管腔细胞中增加(图4C)。免疫荧光分析也证实了TZ中干性相关基因(PSCA、LY6D和SOX2)的富集(图4D)。
这些结果表明，干细胞特性的激活是区分TZ和PZ的一个重要特征，并且在PZ管腔细胞中观察到MYC、E2F和DNA修复途径的过度激活。
Fig 4. 外周区和移行区之间的功能异质性
5.T细胞和巨噬细胞是前列腺免疫景观中两个主要细胞群体
在免疫细胞图谱中，T细胞和巨噬细胞是两个主要的细胞群。首先，作者对CD8 T细胞进行了GSVA分析，与PZ相比，TZ中的CD8 T细胞具有更高的细胞毒性和耗竭评分，这也说明了TZ中具有更复杂的免疫微环境(图5B和5C)。同样地，巨噬细胞在TZ和PZ中也具有显著的功能异质性。TZ中的巨噬细胞具有较高的抗原呈递、TNF‐α和炎症途径活性，并且许多抗原(如HLA-DMA和HLA-C)和细胞因子(如CCL3,4和CXCL2,3,8)相关基因高表达。更重要的是，FOS/JUN等基因可增强巨噬细胞的炎症反应，IRF8可以促进巨噬细胞向M1极化；而MARCO和SPP1与巨噬细胞激活的非炎症性、免疫抑制表型相关(图5D)。巨噬细胞炎症反应的激活和抑制也说明了TZ中的免疫功能紊乱。
Fig 5. TZ中复杂的免疫微环境
经观察TZ中巨噬细胞和其他免疫细胞之间独特的配体-受体对发现，巨噬细胞可通过与受体CCR5相互作用进一步激活和调节CD8 T细胞，并通过CXCR2招募中性粒细胞。更重要的是，TZ中的巨噬细胞可通过IL-1、IL-10（有利于M1极化）和IL-6(有利于M2极化)信号自我调节为促炎和抗炎状态(图5E)。
最后，作者探讨了免疫细胞对前列腺上皮细胞的影响。发现免疫细胞与club/hillock细胞有更多的配体-受体相互作用(图5F)。此外，在巨噬细胞和上皮细胞之间观察到大量的免疫调节相互作用，表明上皮细胞可能在免疫调节中发挥作用。值得注意的是，NK细胞可以通过分泌NOTCH激动剂DLL1、JAG1和TNF刺激club/hillock细胞中的NOTCH信号配体(NOTCH2和NOTCH4)(图5G)。这些结果表明NK细胞可能在club/hillock细胞NOTCH信号维护中发挥作用。
6)TZ中的成纤维细胞表现出更强的免疫和增殖功能
作者在前列腺组织中发现了两种类型的成纤维细胞，分别是iFib(PDGFRA+)和mFib(RGS5+)(图6A)。与之前的研究一致，作者发现iFib中富含IL6和趋化因子如CCL3、CCL2和CXCL12的表达，mFib中表达了较高水平的α-SMA(ACTA2)。差异基因和富集分析表明，ECM、生长因子分泌和IGF-1途径和基因在iFib中显著富集；肌纤维相关通路和基因在mFib中被激活；两种成纤维细胞都分泌各种免疫相关因子(图6B和C)。两种成纤维细胞在TZ中的几乎所有生物学功能都被显著激活，尤其是与免疫和增殖相关的通路(图6C)。
Fig 6. 免疫信号和放疗上调胎儿和癌症干细胞的间充质样程序
通过配体-受体相互作用分析，作者观察到TZ中的成纤维细胞与其他细胞有更多类型的配体-受体相互作用。在成纤维细胞与上皮的相互作用中，发现了TNF、EGF和FGF等常见的增殖途径。成纤维细胞表达分泌的NOTCH激动剂DLL1和JAG1，可以通过在TZ中的club/hillock细胞周围创建局部信号生态位来刺激这些细胞中的NOTCH信号配体(NOTCH1和NOTCH2)(图6D)。
成纤维细胞与免疫细胞的相互作用最强(图6E)。它们表达CXCL、CCL、HLA和CSF家族细胞因子水平升高，尤其是CXCL12，该受体在免疫细胞上广泛表达(图6F和G)。
结论
1、描述了前列腺细胞的异质性和主要的前列腺细胞类型。在上皮细胞中，club和hillock细胞具有较高NOTCH信号活性、神经干特性但低雄激素活性；管腔细胞具有明显的异质性，KLK3+管腔细胞为传统功能管腔细胞，具有较高的雄激素活性；TFF3+管腔细胞具有较高的MYC和E2F通路活性。
2、TZ和PZ之间存在异质性。club和hillock细胞多分布于TZ区，而TFF3+管腔细胞多分布于PZ区。从TZ到PZ，炎症途径相关基因的表达逐渐减少，而雄激素、谱系和DNA修复途径相关基因的表达逐渐增加。在免疫景观中，TZ区的免疫微环境更为复杂和无序，NK和Treg细胞浸润较多。TZ的成纤维细胞密度较高，成纤维细胞功能较强。
团队介绍
科室介绍：
北京医院泌尿外科是国家重点临床学科，在王建业教授和刘明教授的带领下，前列腺癌诊疗技术方面已经走在国内外的前列。目前是亚洲地区唯一能够开展磁共振实时引导靶向穿刺的临床科室，也是我国较早开展超声-磁共振认知/软件融合靶向联合系统性穿刺的科室，在微创腹腔镜手术及晚期前列腺癌治疗领域处于国内领先水平。
通讯作者：
刘明
●北京大学医学部教授，北京大学医学部博士生导师
●北京协和医科大学博士生导师
●中国科学院大学博士生导师
●中华医学会泌尿外科学分会常委、泌尿男科工程学组组长
●中华医学会泌尿外科学分会肿瘤学组委员、基础学组委员、国际交流委员会委员中国抗癌协会泌尿男生殖系肿瘤专业委员会微创学组副组长
●北京医学会泌尿外科分会常委兼秘书长
●NCCN前列腺癌指南国际评审专家
●《中国前列腺增生诊断治疗指南》编写组副组长
参考文献
Yan Q, Wang M, Xia H, Dai C, Diao T, Wang Y, Hou H, Zhang H, Liu M, Long X. Single-cell RNA-sequencing technology demonstrates the heterogeneity between aged prostate peripheral and transitional zone. Clin Transl Med. 2022 Oct.
