1.皮肤鳞状细胞癌单细胞图谱

本文共分析了原发和复发cSCC病人(其中1例原发cSCC为鲍恩病)的6例肿瘤组织及3例癌旁组织单细胞数据，共计14626个细胞。通过聚类分群及细胞注释，共得到了7种主要细胞类型，包括上皮细胞、成纤维细胞、髓系免疫细胞、T细胞、内皮细胞、肥大细胞和B细胞。这些主要细胞类型皆存在着样本异质性。原发cSCC的细胞类型较为均衡，而与原发cSCC相比，复发cSCC组织含有更高比例的成纤维细胞和B细胞。综合而言，上皮细胞、成纤维细胞和髓系免疫细胞是cSCC肿瘤微环境的主要组成细胞。

图1 皮肤鳞状细胞癌单细胞图谱

2.复发cSCC肿瘤特异角质细胞的间充质转化特性

为了解析cSCC中上皮细胞的异质性，作者对上皮细胞进行了亚群细分，共得到了4个上皮细胞亚群，分别是：基底细胞、增殖上皮细胞、分化上皮细胞和肿瘤特异角质细胞(TSKs)。其中，增殖上皮细胞主要包含基底细胞和TSKs。癌旁组织和鲍恩病肿瘤组织含有较高比例的分化上皮细胞，而原发和复发cSCCs肿瘤组织则含有高比例的TSKs。通过RNA速率分析，观察到分化上皮细胞和基底细胞倾向于分化到TSKs。通过富集分析发现，TSKs上调了PI3K-Akt通路、ECM受体相互作用、焦点粘连和HIF-1信号通路相关功能，说明其与肿瘤进展或肿瘤治疗抵抗有关。通过对原发和复发的TSKs进行组间差异分析，发现复发TSKs上调了上皮间充质转化(EMT)相关基因VIM和TGFB1，且EMT基因集合得分在复发样本的TSKs中显著升高。本文作者进而对VIM和TGFB1进行了免疫组化实验的验证，证实了复发cSCC与EMT相关。

图2 复发cSCC肿瘤特异角质细胞的间充质转化特性

3.复发cSCC呈现T细胞荒漠特征

对T细胞亚群细分共得到5个亚群，分别是：CD4+效应T细胞、调节性T细胞(Tregs)、初始CD4+T细胞、CD8+效应T细胞和CD8+细胞毒性T细胞。CD4+和CD8+T细胞在原发cSCC中含量丰富，而在复发cSCC中则呈现了低T细胞浸润的情况，说明复发cSCC是一种T细胞缺失的肿瘤。通过细胞类型相关性计算发现，来自癌旁和原发cSCC的T细胞更为相似，而复发cSCC的T细胞则独立聚类，呈现了与其他样本组织差异较大的表达特性。

紧接着，作者对比了癌旁、原发cSCC和复发cSCC的CD8+效应T细胞和CD8+细胞毒性T细胞的耗竭评分。与癌旁和原发cSCC相比，复发cSCC组的CD8+细胞毒性T细胞显著上调了耗竭功能。作者又查看了免疫检查点抑制因子相关基因的组间差异表达情况，发现原发cSCC组的CD8+效应T细胞高表达了CTLA4和TIGIT，CD8+细胞毒性T细胞也上调了TIGIT。而在复发cSCC组中，CD8+效应T细胞则高表达了HAVCR2(TIM3)和CXCL13，CD8+细胞毒性T细胞高表达了CTLA4和CXCL13，并上调了LAG3表达。以上结果表明了原发和复发cSCC的T细胞耗竭是不同免疫抑制因子导致的。

在此基础上，作者还对炎症相关功能进行了探究。通过对炎症相关通路进行GSVA富集分析，发现CD8+效应T细胞在原发cSCC和癌旁组织中有相似的炎症水平，而在复发cSCC中则下调了TNF和IL-17信号通路水平，且IL-17信号通路水平也在复发组cSCC的CD8+细胞毒性T细胞中显著下调。此外，GSEA富集分析发现，与原发cSCC相比，复发cSCC的CD8+细胞毒性T细胞显著上调了氧化磷酸化功能，说明这些细胞处在高代谢状态。

综合而言，作者揭示了复发cSCC中的T细胞浸润水平低，且T细胞处于低炎症状态，这有可能是cSCC复发的重要原因。

图3 cSCC肿瘤微环境中T细胞的组成和转录组特征

 

4.SPP1+CD209^high/low肿瘤相关巨噬细胞的促肿瘤特性

髓系免疫细胞是cSCC肿瘤微环境中最为丰富的细胞类型，且已有报道称其参与了肿瘤进展和转移，因此作者对髓系免疫细胞进行了亚群细分。髓系细胞亚群细分共得到了10个亚群，其中4个群为肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)，分别是：SPP1+CD209^highTAMs、SPP1+ CD209^lowTAMs、CXCL10+TAMs和增殖TAMs。除此之外，还注释到了单核细胞(Monocytes)、树突细胞(DCs)和髓源抑制免疫细胞(MDSCs)等细胞亚群。RNA速率分析发现TAMs和DCs有分化向单核细胞的倾向，而MDSCs则位于分化轨迹末端，CytoTRACE分化潜能分析进一步确认了RNA速率分析的结果。有文献报道巨噬向单核分化方向与cAMP信号相关，而在数据中也看到了cAMP信号通路水平与分化拟时序显著负相关。

近来有研究表明，SPP1+TAMs亚群存在血管生成相关特性，并与肿瘤转移相关。在本文数据中，存在两群在复发cSCC中占比较高的SPP1+TAMs，分别是SPP1+CD209^highTAMs和SPP1+CD209^lowTAMs。因此作者进一步分析了这两群细胞的吞噬功能和血管生成功能，并发现SPP1+CD209^highTAMs亚群拥有更高的吞噬功能得分，而SPP1+CD209^lowTAMs亚群则拥有最高的血管生成功能得分。另外，CD1a+CD1c+DCs是吞噬功能水平最高的髓系免疫细胞亚群。通过组间对比发现，SPP1+CD209^highTAMs和CD1a+CD1c+DCs的吞噬功能水平都在复发cSCC组显著下调。且SPP1+CD209^highTAMs的血管生成功能水平在原发和复发cSCCs组中皆显著上调。此外，作者也对炎症相关通路进行了分析，发现TAMs和单核细胞拥有较高的炎症水平，且SPP1+TAMs和单核细胞亚群的炎症水平存在组间差异。综上，复发cSCC组SPP1+TAMs的吞噬功能和炎症水平下降，但上调了血管生成水平，这有可能是导致cSCC复发的机制。

5.复发cSCC中IL7R+癌症相关成纤维细胞与肿瘤特异角质细胞的细胞互作

成纤维细胞是肿瘤微环境中另一重要细胞类型，通过亚群细分共得到了3个癌症相关成纤维(CAFs)亚群，分别是：mCAFs、iCAFs和IL7R+CAFs。值得注意的是，复发cSCC中含有更多的IL7R+CAFs，而原发cSCC则含有更高比例的mCAFs。RNA速率分析发现iCAFs可以分化成mCAFs进而分化成IL7R+CAFs，这与原发和复发的CAFs亚群细胞比例变化趋势一致，从而可以认为CAFs细胞亚群的分化与cSCC复发相关。同样，在IL7R+CAFs亚群中也看到了炎症水平的变化。与癌旁组织相比，原发cSCC中的细胞炎症水平稍有升高，而复发cSCC中的细胞验证水平则显著下调，揭示了cSCC复发存在IL7R+CAFs低炎症水平的特征。

为了进一步了解IL7R+CAFs的生物学功能，作者进行了细胞互作分析，结果显示IL7R+CAFs高表达了与EMT相关的配体，而分析与这些配体基因相关的受配体对，发现TSKs与IL7R+CAFs的互作水平最强。因此，在复发cSCC中，IL7R+CAFs可以通过与TSKs的细胞互作促进TSKs的EMT功能。

图5 cSCC中癌症相关成纤维细胞转录组变化与细胞互作

6.细胞互作分析揭示MDK通路在复发cSCC中的作用

上述分析结果均揭示了原发和复发cSCC中免疫微环境细胞比例和细胞功能上的差异，作者认为原发和复发cSCC存在细胞间互作差异，于是作者进一步对原发和复发cSCC分别进行了细胞互作分析。结果显示，在原发cSCC中，iCAFs和IL7R+CAFs与其他细胞类型有更多的互相作用；而在复发cSCC中，TSKs、iCAFs、mCAFs和IL7R+CAFs与其他细胞类型的相互作用更多，TSKs在复发cSCC免疫微环境中发挥了更重要的作用。对比原发和复发cSCC与TSKs相关的细胞互作，发现复发cSCC组上调了MDK通路。MDK被报道在多种癌症中与细胞分化、生长、迁徙、血管生成及生存时间相关。在原发cSCC中，iCAFs和IL7R+CAFs可以分泌高水平的MDK以影响细胞间互相作用；而在复发cSCC中，则是TSKs分泌高水平的MDK，而其受体表达在TSKs和其他细胞类型中，从而调节了TSKs与其他细胞类型的强细胞互作。对MDK和成纤维细胞marker基因VIM的实验证实了其作用：与原发cSCC相比，第一次和第二次复发cSCC样本中有更高的MDK表达。并且，MDK表达与VIM和TGFB1正相关，证明它可能可以调控cSCC的EMT功能。

图6 原发和复发cSCC细胞互作差异

此研究对原发和复发的皮肤鳞状细胞癌组织及癌旁组织进行了单细胞测序，探索原发和复发cSCC肿瘤微环境的变化。结果揭示了复发cSCC高EMT、高免疫抑制及低炎症水平的独特免疫微环境，体现在细胞占比、转录特性、功能和细胞通讯的差异上。其中多个结论可能是cSCC肿瘤进展的重要机制，为今后干预cSCC肿瘤进展及治疗复发cSCC提供了新的思路和方向。

Li, X., Zhao, S., Bian, X.,et al. (2022). Signatures of EMT, immunosuppression, and inflammation in primary and recurrent human cutaneous squamous cell carcinoma at single-cell resolution. Theranostics,12(17),7532-7549.