图1 恩格列净对非糖尿病CKD肾病理的影响

2.非糖尿病CKD模型单细胞图谱

数据质控后，得到89420个细胞，分为14个细胞群，T细胞(CD3G)、髓系细胞(LYZ2)、近端小管细胞(LRP2)、远端小管细胞(SLC12A3)、Henle环(SLC12A1)、收集管主细胞(AQP2)和收集管间插细胞(FOXIL)、输尿管上皮(UPK3A)、内皮细胞(CDH5)、纤维细胞(DCN)的簇，系膜细胞(ITGA8)、平滑肌细胞(TAGLN)、周细胞(RGS5)和增殖细胞(TOP2A)。各亚群组间比例比较发现Sham组中髓系细胞较少，而在5/6Nx组中髓系细胞显著增加，在恩格列净治疗后显著减少，成纤维细胞百分比的变化与髓系细胞成比例，表明髓系细胞和成纤维细胞之间存在密切联系，因此后续研究重点将放在髓系细胞和成纤维细胞上。

图2 非糖尿病CKD的主要细胞类型

3.恩格列净治疗前后M2巨噬细胞的特异性变化

将髓系细胞分为6个亚群，包括M1巨噬细胞(IL1B)、M2巨噬细胞(C1QB)、单核细胞(SELL)和3个树突状细胞亚群。亚群组间细胞比例比较发现5/6Nx组中单核细胞和M1巨噬细胞的比例显著降低，而M2巨噬细胞的比率显著增加，这表明大多数单核细胞或M1巨噬细胞可能已转化为M2巨噬细胞。在恩格列净治疗后，M2巨噬细胞的比例明显降低，M1巨噬细胞的数量随之增加。恩格列净除了调控M2巨噬细胞极化，还降低了M2巨噬细胞中的基因转录水平，尤其是M2巨噬细胞极化基因(GPNMB、LGALS3、PRDX5和CTSB)和促纤维化基因，在恩格列净治疗后显著降低，以上结果表明恩格列净在抑制M2极化过程发挥重要作用。

对M2巨噬细胞亚群进行monocle2拟时序分析，确定了5个不同的发育状态，状态1为早期分化阶段的M2细胞，强烈表达分裂相关基因。状态2为主要参与免疫反应的巨噬细胞。M2极化标记基因在状态4和状态5中上调，CD206⁺CD68⁺M2巨噬细胞已被证明具有转化为纤维细胞的潜力，但是作者仅在状态5的M2巨噬细胞中发现了纤维化相关基因的过度表达和成纤维细胞增殖的活性生物学过程，而在状态4的M2细胞中没有发现，说明状态5中M2巨噬细胞表型是CKD中纤维化发生的主要原因。恩格列净在状态3和状态5下显著抑制M2巨噬细胞的产生。以上结果表明CD206⁺CD68⁺M2巨噬细胞从状态1到状态3到状态5的促纤维化极化的过程，恩格列净对M2巨噬细胞的极化起靶向作用。

4.CD206⁺CD68⁺M2巨噬细胞极化的调节机制

基于GSVA分析发现，CD206⁺CD68⁺M2巨噬细胞在极化过程中溶酶体、线粒体吞噬和mTOR途径逐渐增强，但是在恩格列净治疗后，上述通路的富集程度减弱(图4a)。图4b描绘了假时间内相关通路中基因表达的变化，这些基因在5/6Nx组中随着时间的推移而增加，而恩格列净显著抑制了它们的表达水平，尤其是在CD206⁺CD68⁺巨噬细胞中。使用SCENIC分析3个状态M2巨噬细胞的TF调节活性，并构建了以TF为中心的基因共表达网络。CD206⁺CD68⁺M2巨噬细胞特异性TF显示参与溶酶体、线粒体吞噬和mTOR途径的基因调控，假时间基因表达分析发现恩格列净对MEIS3、TFEC、CEBPD、EGR1、ATF4和MXD4的表达有抑制作用。

5.T细胞亚群与M2巨噬细胞之间的细胞通讯

T细胞共分为4个亚群，包括CD8⁺效应T细胞(NKG7)、辅助T细胞17(CCR6)、调节性T细胞(TNFRSF4)和滤泡辅助T细胞(CXCR6)，用cellphone DB进行细胞通讯分析，发现5/6Nx组中M2巨噬细胞与T细胞亚群之间存在较多互作关系对(图5c)，恩格列净有效减少M2巨噬细胞与T细胞间互作对的数量，表明恩格列净干扰了M2巨噬细胞与T细胞之间的细胞通讯。Top受体配体对显示，恩格列净抑制CSF2-CSF1R、COPA-P2RY6、TNFSF14-LTBR、TNFRSF1B-GRN和CCL5-CCR1的水平，而激活LAMP1-FAM3C和SPP1-CD44的表达。接下来深入研究CCL5-CCR1下游基因在CD8⁺效应T细胞与M2巨噬细胞之间互作过程中的作用，文献研究表明CCL5-CR1基因敲除在肾小球硬化小鼠中具有较强的抗纤维化作用，但是作者也不能排除其他受体配体对对肾纤维化的影响。接下来作者使用NicheNet进行细胞通讯分析，图5e为T细胞亚群与M2巨噬细胞top配体活性热图，结果与cellphone DB一致，恩格列净可以降低CCL5配体活性。图5f为T细胞亚群top配体与M2巨噬细胞亚群预测的靶基因调节热图，发现ATF3、CCL2、CEBPB、FOS、DUSP1、ITGB2、JUN、LMNA、TRIB1、UBC、ZFP36L1、FN1和EGR1是CCL5的主要预测靶基因，其中ATF3、FOS、TRIB1和EGR1是影响巨噬细胞极化的关键基因。通过Circos图分析确定CCR1和CCR5是CCL5信号传导的主要受体，这些受体和CCL5的靶基因在CD206⁺CD68⁺M2巨噬细胞极化过程中表现出上升趋势，并且在恩格列净治疗后部分减弱，表明恩格列净可能通过调节CCL5-CCR1下游基因表达来抑制CD206⁺CD68⁺M2巨噬细胞极化。以上结果表明恩格列净可能通过干扰CCL5-CCR1信号、mTOR有丝分裂和溶酶体途径来抑制M2巨噬细胞极化，这些发现为逆转或抑制CKD期间的纤维化发展提供了潜在的策略。

图5 恩格列净对T细胞亚群和M2巨噬细胞之间细胞通讯的抑制作用

(1)通过肾功能与病理监测证明恩格列净能有效缓解非糖尿病CKD的症状；

(2)M2巨噬细胞从状态1(CD206^-CD68^-M2巨噬细胞)到状态5(CD206⁺CD68⁺M2巨噬细胞)的极化是主要的促纤维化过程，CD206⁺CD68⁺M2巨噬细胞高度表达促纤维化基因并可转化为纤维细胞；

(3)恩格列净显著抑制CD206⁺CD68⁺M2巨噬细胞中纤维化促进基因(IFG1和TREM2)和极化相关基因(GPNMB、LGALS3、PRDX5和CTSB)的表达，并减弱CD8⁺效应T细胞的炎症信号；

(4)恩格列净对CD206⁺CD68⁺M2巨噬细胞极化的抑制作用主要通过影响线粒体吞噬和mTOR途径实现；

(5)5/6Nx组中M2巨噬细胞与T细胞亚群之间存在较多互作关系对，恩格列净干扰了M2巨噬细胞与T细胞之间的细胞通讯；

(6)恩格列净能通过调节CCL5-CCR1下游基因表达来抑制CD206⁺CD68⁺M2巨噬细胞极化；

总之，SGLT2抑制剂对非糖尿病CKD的作用机制主要是由于靶向CD8⁺效应T细胞的mTOR和有丝分裂途径并减弱炎症信号，从而抑制了CD206⁺CD68⁺M2巨噬细胞极化，对非糖尿病CKD的治疗策略有着重要的意义。