1.scRNA-seq揭示了CD226在胸腺T细胞发育中的意义

为了确定CD226分子在胸腺T细胞发育中的作用，研究者使用Singleron GEXSCOPE平台对5周龄CD226 KO小鼠和对照的野生型(WT)小鼠的胸腺细胞进行了scRNA-seq(图1a)。通过质量控制并分别获得了26962个(WT)和26283个(KO)胸腺细胞；利用UMAP对细胞群进行识别和可视化，大多数胸腺细胞被鉴定为T细胞(图1b)。然后将T细胞进一步细分聚类为7个亚群，然后使用之前报道的marker进行了注释(图1c)，并对T细胞每个cluster的前10个特征基因进行了展示。拟时序分析显示，WT和CD226KO小鼠的胸腺细胞发育轨迹如下：DNT、DPT-P、DPT-Q、CD4+/CD8+ SP T细胞(CD4/CD8 T)(图1c,e)，这与前人的报道一致。

图1 scRNA-seq揭示了CD226在胸腺T细胞发育中的重要性

CD226 KO组胸腺细胞各亚群的分布和比例发生了显著变化(图2a)。与WT小鼠相比，CD226KO小鼠的CD8+ SP胸腺细胞比例显著降低，DPT-Q细胞比例显著增加(图2a,b)。然后，研究者又通过流式细胞术分析证实，CD226敲除降低了胸腺中CD8 T细胞的比例，增加了DPT细胞的比例(图2c)。通过对DPT-Q、CD4+ T和CD8+ T细胞进行Monocle 2拟时序表明，CD226敲除一定程度上阻止DPT-Q分化为CD8+ T细胞(图2d,e)。提示CD226在胸腺T细胞的发育过程中起重要作用，尤其是在DPT-Q向CD8+ T细胞的转化过程中。

图2 CD226敲除破坏胸腺T细胞发育

2.CD226在DPT期开始高表达 

基于CD226在胸腺T细胞发育中的重要作用，研究者检测了WT小鼠中不同发育阶段的T细胞中CD226的表达情况。首先是通过jitter图显示了在T细胞分化的假时间过程中CD226的表达(图3a)，发现：CD226不表达于DNT期之前的各阶段胸腺细胞，在DPT-Q期开始表达，在CD4+、CD8+和NKT细胞等终末分化T细胞中表达最高。接着，采用流式细胞术检测WT小鼠胸腺中CD226蛋白的表达水平，发现：CD226水平按照DNT、DPT、CD4+ T和CD8+ T细胞的顺序逐渐升高，其中CD226在DNT中表达最低，但在DPT期显著升高(图3b,c)。这表明CD226在DPT细胞中起重要作用。此外，CD8+ T细胞中CD226的表达显著高于其他亚群，这可能是CD226敲除主要影响了CD8+ T细胞发育和功能的原因之一。

图3 CD226在DPT期开始高表达

CD226敲除抑制DPT-Q向CD8+ T细胞的发育，DPT-Q是T细胞向SP细胞发育的关键阶段。接下来，文章作者进一步对DPT-Q细胞展开研究。首先将DPT-Q细胞进行进一步分群，分为5个亚群，使用UMAP进行数据分析和可视化(图4a)。通过UMAP图可以看出，CD226敲除导致DPT-Q中缺少簇2、3和5(图4c)。同时作者也对这些亚群的特征基因以热图的形式进行了展示。簇2可以由Granzyme A (Gzma)注释(图4e)，而Granzyme A是一种选择性地表达于CTL和NK细胞的丝氨酸蛋白酶，诱导肿瘤细胞和病毒感染细胞死亡，表明Gzma⁺ Cluster 2可能进一步发展为CD8+ T细胞。这些结果表明，CD226敲除抑制DPT-Q的发育，Gzma⁺亚群的缺失可能是CD8+ T发育障碍的潜在原因。

图4 CD226敲除阻碍DPT-Q向CD8+ T细胞的发育

3.CD226的缺失通过减弱TCR信号强度阻碍了T细胞的阳性选择

DPT-Q期的阳性选择对T细胞向SP(单阳性)细胞的发育至关重要，DPT细胞只有接收到合适强度的TCR信号，才能通过阳性选择，继续存活和成熟。CD5的水平在阳性选择过程中受到严格的调控，并且CD5的表达反映了TCR转导信号的强度，CD5+ Cluster 3被鉴定为正在发生阳性选择的DPT细胞。接下来，文章作者对CD5+ Cluster 3细胞展开了研究，jitter图显示CD5表达增加，之后随拟时序顺序降低，反映了DPT细胞经历阳性选择的动态过程(图5a)。鉴于CD226敲除造成CD5+ Cluster 3细胞的显著减少(图4c)，文章作者进一步研究了CD226是否影响DPT细胞的TCR信号强度。基于scRNA-seq的气泡图显示，CD226 KO小鼠的DPT-Q和CD5+ DPT-Q细胞中TCR下游信号分子如Lck、Lat和Zap70的基因表达均下调(图5b)。WT和CD226 KO 组DPT细胞之间差异基因的富集分析指向TCR下游的MAPK等相关信号通路(图5c)。GO富集分析也显示了TCR信号的一致结果，如分子功能中的转录因子和蛋白激酶结合，细胞成分中的细胞质，以及生物过程中的细胞分化(图5d)。

图5 CD226基因敲除减弱了阳性选择中的TCR信号强度

 

4.CD226通过调控AKT活性调控DPT细胞凋亡

细胞凋亡是胸腺细胞进行阳性选择和决定成熟单阳性T细胞数量的最重要机制，研究者通过流式细胞术检测了WT和CD226KO小鼠胸腺细胞凋亡水平。WT胸腺细胞和CD226KO胸腺细胞中CD4+和CD8+ SP细胞的百分比没有显著差异，而CD226缺陷的DPT细胞显示出更高的凋亡水平(图6a)。

AKT通路参与细胞存活/凋亡的调节，当TCR被激活时，其下游元件NF-κB、AKT和MAPK发生级联磷酸化。然而，在CD226缺陷的DPT细胞中，AKT在Ser473位点的磷酸化、ERK在Thr202/ Tyr204位点的磷酸化、NF-κB在Ser536位点的磷酸化和P38在Thr180/Tyr182位点的磷酸化显著降低(图6b)。与WT DPT细胞相比，CD226缺陷的DPT细胞表现出更高的凋亡水平，AKT激活剂SC79显著逆转了这种凋亡水平(图6c)。

同时，促凋亡相关蛋白Bax和cleaved-caspase 3在CD226缺陷的DPT细胞中表达上调。AKT抑制剂增强了DPT细胞中Bax和cleaved-caspase 3的表达，AKT激活剂显著逆转了CD226缺陷的DPT细胞中Bax和cleaved-caspase 3的上调(图6d)。上述结果表明，CD226可以通过调节AKT活性来调控DPT细胞凋亡，TCR信号强度减弱是CD226 KO小鼠阳性选择受损和胸腺细胞发育障碍的原因。

图6 CD226敲除通过调控AKT磷酸化促进DPT细胞凋亡