结直肠癌是全球第三大常见癌症，也是癌症相关死亡的第二大原因。粘液腺癌(MC)是一种独特的结直肠癌亚型，其特征是其粘液成分至少占肿瘤体积的50%。目前MC患者的治疗基于与AC相同的标准指南，MC的预后是否与AC不同仍有争议，其独特的生物学行为尚未得到很好的解释。本研究利用scRNA-seq揭示了MC癌细胞的杯状细胞特性，有助于阐明不同肿瘤特异性的生物学特征，并解释粘液产生的调节机制。
方法流程
为了研究MC肿瘤特征，作者收集了4例AC和3例MC患者的手术原发肿瘤标本，进行单细胞RNA测序(scRNA-seq)，获得61,279个高质量细胞数据(AC组33,778个细胞；MC组27,501个细胞)，并对所有细胞进一步分析。
研究结果
1.黏液腺癌细胞图谱构建
作者首先通过HE染色的方法对选择的样本进行确认，发现MC组样本中有明显的粘液成分。通过对细胞聚类注释分析，作者鉴定出9种细胞类型，包括癌细胞、正常上皮细胞、内皮细胞、周细胞、成纤维细胞、浆细胞、髓系细胞、T细胞和B细胞。基于InferCNV分析确定了癌细胞鉴定的准确性，不同患者的癌细胞基本是单独成群，体现了肿瘤异质性特征。此外，通过细胞组成的比较，作者发现AC组中上皮细胞和浆细胞的比例明显高于MC组。
图1 AC及MC肿瘤细胞图谱
2.MC肿瘤细胞转录异质性特征
肿瘤细胞进一步细分获得7个细胞簇，不同患者的肿瘤细胞表现出高度异质性和患者特异性表达特征。MC癌细胞高表达与粘液形成和稳定相关基因。利用基因集变异分析(GSVA)发现，C1通过NF-kB富集TNFα信号，C2和C6在E2F和MYC信号通路中富集，C3在hedgehog、MYC和氧化磷酸化信号通路中富集，C4通过NFkB、IFN-α和KRAS信号通路富集TNFα，C5在上皮-间充质转化和血管生成信号通路中富集，而C7在MYC和氧化磷酸化信号通路中富集。这些结果进一步表明结直肠癌是一种高度异质性疾病。
基于拷贝数变异分析发现，与AC相比，MC表现出特定的染色体区域CNV水平变化，包括4p和5p拷贝数增加以及19p拷贝数减少。基于ITHcna分析，作者观察到肿瘤内部存在不同程度的异质性，但MC与AC之间无显著差异。
图2 癌细胞瘤间及瘤内异质性
3.MC癌细胞独特的分子特征
通过比较MC癌细胞与AC癌细胞的特定基因表达模式，作者发现MC表达高水平的REG4、FCGBP、TFF1、FAM3D和REG1A，已被报导在保护肠粘膜和稳定粘膜层中发挥重要作用。GSVA分析发现，MC癌细胞特异性富集蛋白质分泌、TNFα信号通路和早期雌激素反应相关的信号通路。AC癌细胞特异性富集与MYC和氧化磷酸化相关的信号通路。
为了进一步确定MC和AC癌细胞的表型，作者使用Hotspot无监督聚类方法对功能基因集进行聚类。通过Jaccard相似性分析，将模块基因分为MC或AC特征基因。模块2、5、6、8主要在MC中富集，杯状细胞标记基因REG4、FCGBP、SPINK4和MUC2属于模块5。为了确认相关分子的表达，作者收集了9对配对的MC组织(癌和正常)和9对配对的AC组织(癌和正常)进行免疫组化分析，确定了目标基因在MC组中的高表达特征，并初步推测REG4、FCGBP、SPINK4和MUC2是MC特异性表型的关键基因，可能改善MC的预后，并通过TCGA生存分析进一步验证。
图3 MC癌细胞的特异性分子特征
4.MC上皮细胞拟时序分析
通过MC，AC肿瘤细胞差异基因发现，MC癌细胞表达高水平杯状细胞标志物，而AC癌细胞高表达肠上皮和干细胞标志物。这种差异可能是由于癌细胞的来源不同。基于Monocle 2对上皮细胞(癌细胞、肠上皮细胞和杯状细胞)进行了轨迹分析，发现AC癌细胞与大多数上皮细胞在终末期发育状态相同，而大多数MC癌细胞和杯状细胞在轨迹路径开始时表现出相同的发育状态，结果表明，MC癌细胞具有杯状细胞样基因表达特征，其发育轨迹与杯状细胞相似。
图4 AC及MC上皮细胞发育轨迹
5.MC肿瘤细胞转录调控特征
为了全面了解MC癌细胞和杯状细胞之间的相关性，作者分析了8种典型结肠杯状细胞标记物在拟时轨迹上的表达，和预测的一致，所有标记物的表达沿轨迹明显降低。在单细胞水平上作者进一步分析了粘蛋白家族基因的表达，MUC家族基因在肿瘤细胞和上皮细胞中特异性高表达。为了解析MUC2的调控机制，作者进一步从公共数据库中获得了MUC2转录调控因子的数据集，并评估了沿转录轨迹的前34个转录因子的表达，TFF3和FOS的表达在此过程中明显降低，提示它们可能参与了MC癌细胞MUC2的调控。对AC和MC肿瘤细胞进行转录调控分析，并根据调控强度列出了前50位的结果。AC的调控网络主要集中在PBL6、SUCLG1、TFF3、HMGB1、HMGB2和PBS4X上，MC的调控网络主要集中在RPS4X、TFF3、HMGB2和RPL6上。这些结果表明，HMGB2、MKI67和TOP2A(增殖相关基因)在两组间具有相似的调节作用。特别是在MC组，TFF3调节了几种典型的杯状细胞标志物，如MUC2、SPINK4、REG4、AGR2和FCGBP。
图5 黏液性腺癌中杯状细胞的特征及黏液蛋白的调节
6.MC中肿瘤相关成纤维细胞特征
对成纤维细胞进一步细分获得8个细胞群，2个成纤维细胞群以及6个肌成纤维细胞群。AC中成纤维细胞-1和肌成纤维细胞-6的比例明显高于MC。GSVA分析显示成纤维细胞-1在IL6-JAK-STAT3信号通路富集；肌成纤维细胞-6通过NF-kB和缺氧信号通路富集TNFα。
肿瘤微环境中不同细胞类型之间的串扰是导致肿瘤进展的关键因素。作者进一步对AC和MC进行了细胞大类相互作用分析，通过比较AC和MC的相互作用网络，发现癌细胞与成纤维细胞的通信在MC中显著增加。EGFR-COPA和NRG1-LGR4对在AC肿瘤中的表达水平高于MC肿瘤，而在MC组中发现癌细胞和成纤维细胞之间增强的VEGFA-FLT1信号，在肿瘤血管生成和进展中发挥重要作用。此外，MC中TNFSF10-RIPK136和TNFRSF11B-TNFSF10相互作用明显增强，说明在MC组具有增强的抗凋亡活性和信号，这些结果表明，癌细胞和成纤维细胞之间通过不同的受体-配体信号的串扰，可能对MC独特的表型产生深远的影响。
图6 肿瘤相关成纤维细胞转录特征分析
结论
本研究通过单细胞RNA转录组学证明了MC和AC之间的肿瘤微环境差异。鉴定了几种特定标记物的成纤维细胞簇。此外，作者揭示了MC和AC中癌细胞和成纤维细胞之间的通讯网络关系。重要的是，该研究结果突出了MC癌细胞的杯状细胞特征，并从多个角度描述了粘液合成和分泌的机制。总的来说，该研究为理解MC提供了独特的视角。
参考文献
Single-cell profiling reveals differences between human classical adenocarcinoma and mucinous adenocarcinoma. Commun Biol. 2023 Jan 23;6(1):85. doi: 10.1038/s42003-023-04441-w.
