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项目文章 | 单细胞测序揭示粘液腺癌单细胞水平异质性
发布时间:2023-02-24 14:15:33  

2023年1月23日北京大学肿瘤医院胃肠肿瘤中心三病区武爱文教授团队在国际著名杂志Communications Biology(Q1 BIOLOGY)发表了题目为“Single-cell profiling reveals differences between human classical adenocarcinoma and mucinous adenocarcinoma”的研究成果,该研究基于单细胞转录组测序技术,利用结直肠普通腺癌(AC)和粘液腺癌(MC)手术组织样本,探讨了AC和MC细胞水平的肿瘤微环境差异。粘液腺癌癌细胞具有杯状细胞的特性,并且表达高水平的杯状细胞标志物;TFF3对这些分子的转录调控至关重要,并可能与RPS4X互作最终导致粘液腺癌黏液表型。该研究为理解MC提供了独特的视角。

新格元在该研究中承担了单细胞转录组测序以及单细胞数据生信分析等工作。

下面和元小新一起来看看吧~

 

研究背景

 

结直肠癌是全球第三大常见癌症,也是癌症相关死亡的第二大原因。粘液腺癌(MC)是一种独特的结直肠癌亚型,其特征是其粘液成分至少占肿瘤体积的50%。目前MC患者的治疗基于与AC相同的标准指南,MC的预后是否与AC不同仍有争议,其独特的生物学行为尚未得到很好的解释。本研究利用scRNA-seq揭示了MC癌细胞的杯状细胞特性,有助于阐明不同肿瘤特异性的生物学特征,并解释粘液产生的调节机制。

 

方法流程

为了研究MC肿瘤特征,作者收集了4例AC和3例MC患者的手术原发肿瘤标本,进行单细胞RNA测序(scRNA-seq),获得61,279个高质量细胞数据(AC组33,778个细胞;MC组27,501个细胞),并对所有细胞进一步分析。

 

研究结果

 

1.黏液腺癌细胞图谱构建

作者首先通过HE染色的方法对选择的样本进行确认,发现MC组样本中有明显的粘液成分。通过对细胞聚类注释分析,作者鉴定出9种细胞类型,包括癌细胞、正常上皮细胞、内皮细胞、周细胞、成纤维细胞、浆细胞、髓系细胞、T细胞和B细胞。基于InferCNV分析确定了癌细胞鉴定的准确性,不同患者的癌细胞基本是单独成群,体现了肿瘤异质性特征。此外,通过细胞组成的比较,作者发现AC组中上皮细胞和浆细胞的比例明显高于MC组。

图1  AC及MC肿瘤细胞图谱

 

2.MC肿瘤细胞转录异质性特征

 

肿瘤细胞进一步细分获得7个细胞簇,不同患者的肿瘤细胞表现出高度异质性和患者特异性表达特征。MC癌细胞高表达与粘液形成和稳定相关基因。利用基因集变异分析(GSVA)发现,C1通过NF-kB富集TNFα信号,C2和C6在E2F和MYC信号通路中富集,C3在hedgehog、MYC和氧化磷酸化信号通路中富集,C4通过NFkB、IFN-α和KRAS信号通路富集TNFα,C5在上皮-间充质转化和血管生成信号通路中富集,而C7在MYC和氧化磷酸化信号通路中富集。这些结果进一步表明结直肠癌是一种高度异质性疾病。

基于拷贝数变异分析发现,与AC相比,MC表现出特定的染色体区域CNV水平变化,包括4p和5p拷贝数增加以及19p拷贝数减少。基于ITHcna分析,作者观察到肿瘤内部存在不同程度的异质性,但MC与AC之间无显著差异。

图2  癌细胞瘤间及瘤内异质性

 

3.MC癌细胞独特的分子特征

 

通过比较MC癌细胞与AC癌细胞的特定基因表达模式,作者发现MC表达高水平的REG4、FCGBP、TFF1、FAM3D和REG1A,已被报导在保护肠粘膜和稳定粘膜层中发挥重要作用。GSVA分析发现,MC癌细胞特异性富集蛋白质分泌、TNFα信号通路和早期雌激素反应相关的信号通路。AC癌细胞特异性富集与MYC和氧化磷酸化相关的信号通路。

为了进一步确定MC和AC癌细胞的表型,作者使用Hotspot无监督聚类方法对功能基因集进行聚类。通过Jaccard相似性分析,将模块基因分为MC或AC特征基因。模块2、5、6、8主要在MC中富集,杯状细胞标记基因REG4、FCGBP、SPINK4和MUC2属于模块5。为了确认相关分子的表达,作者收集了9对配对的MC组织(癌和正常)和9对配对的AC组织(癌和正常)进行免疫组化分析,确定了目标基因在MC组中的高表达特征,并初步推测REG4、FCGBP、SPINK4和MUC2是MC特异性表型的关键基因,可能改善MC的预后,并通过TCGA生存分析进一步验证。

图3  MC癌细胞的特异性分子特征

 

4.MC上皮细胞拟时序分析

 

通过MC,AC肿瘤细胞差异基因发现,MC癌细胞表达高水平杯状细胞标志物,而AC癌细胞高表达肠上皮和干细胞标志物。这种差异可能是由于癌细胞的来源不同。基于Monocle 2对上皮细胞(癌细胞、肠上皮细胞和杯状细胞)进行了轨迹分析,发现AC癌细胞与大多数上皮细胞在终末期发育状态相同,而大多数MC癌细胞和杯状细胞在轨迹路径开始时表现出相同的发育状态,结果表明,MC癌细胞具有杯状细胞样基因表达特征,其发育轨迹与杯状细胞相似。

图4  AC及MC上皮细胞发育轨迹

 

5.MC肿瘤细胞转录调控特征

 

为了全面了解MC癌细胞和杯状细胞之间的相关性,作者分析了8种典型结肠杯状细胞标记物在拟时轨迹上的表达,和预测的一致,所有标记物的表达沿轨迹明显降低。在单细胞水平上作者进一步分析了粘蛋白家族基因的表达,MUC家族基因在肿瘤细胞和上皮细胞中特异性高表达。为了解析MUC2的调控机制,作者进一步从公共数据库中获得了MUC2转录调控因子的数据集,并评估了沿转录轨迹的前34个转录因子的表达,TFF3和FOS的表达在此过程中明显降低,提示它们可能参与了MC癌细胞MUC2的调控。对AC和MC肿瘤细胞进行转录调控分析,并根据调控强度列出了前50位的结果。AC的调控网络主要集中在PBL6、SUCLG1、TFF3、HMGB1、HMGB2和PBS4X上,MC的调控网络主要集中在RPS4X、TFF3、HMGB2和RPL6上。这些结果表明,HMGB2、MKI67和TOP2A(增殖相关基因)在两组间具有相似的调节作用。特别是在MC组,TFF3调节了几种典型的杯状细胞标志物,如MUC2、SPINK4、REG4、AGR2和FCGBP。

 

图5  黏液性腺癌中杯状细胞的特征及黏液蛋白的调节

图5  黏液性腺癌中杯状细胞的特征及黏液蛋白的调节

 

 

6.MC中肿瘤相关成纤维细胞特征

 

对成纤维细胞进一步细分获得8个细胞群,2个成纤维细胞群以及6个肌成纤维细胞群。AC中成纤维细胞-1和肌成纤维细胞-6的比例明显高于MC。GSVA分析显示成纤维细胞-1在IL6-JAK-STAT3信号通路富集;肌成纤维细胞-6通过NF-kB和缺氧信号通路富集TNFα。

肿瘤微环境中不同细胞类型之间的串扰是导致肿瘤进展的关键因素。作者进一步对AC和MC进行了细胞大类相互作用分析,通过比较AC和MC的相互作用网络,发现癌细胞与成纤维细胞的通信在MC中显著增加。EGFR-COPA和NRG1-LGR4对在AC肿瘤中的表达水平高于MC肿瘤,而在MC组中发现癌细胞和成纤维细胞之间增强的VEGFA-FLT1信号,在肿瘤血管生成和进展中发挥重要作用。此外,MC中TNFSF10-RIPK136和TNFRSF11B-TNFSF10相互作用明显增强,说明在MC组具有增强的抗凋亡活性和信号,这些结果表明,癌细胞和成纤维细胞之间通过不同的受体-配体信号的串扰,可能对MC独特的表型产生深远的影响。

图6  肿瘤相关成纤维细胞转录特征分析

 

结论

本研究通过单细胞RNA转录组学证明了MC和AC之间的肿瘤微环境差异。鉴定了几种特定标记物的成纤维细胞簇。此外,作者揭示了MC和AC中癌细胞和成纤维细胞之间的通讯网络关系。重要的是,该研究结果突出了MC癌细胞的杯状细胞特征,并从多个角度描述了粘液合成和分泌的机制。总的来说,该研究为理解MC提供了独特的视角。

 

参考文献

Single-cell profiling reveals differences between human classical adenocarcinoma and mucinous adenocarcinoma. Commun Biol. 2023 Jan 23;6(1):85. doi:  10.1038/s42003-023-04441-w.

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