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项目文章 | 单细胞联合微生物组揭示肝内胆管癌的抗肿瘤潜力

发布时间：2023-03-29 13:53:02

2022年12月23日，复旦大学附属中山医院在Gut Microbes期刊上发表了题为“Intratumor microbiome features reveal antitumor potentials of intrahepatic cholangiocarcinoma”的研究成果。该研究通过对肝内胆管癌(ICC)组织进行16S rRNA测序，确定了瘤内微生物群的特征。随后，进行了单细胞RNA测序(scRNA-seq)和多个层面上的验证，并使用染色、荧光原位杂交(FISH)和透射电子显微镜(TEM)确定了组织中微生物DNA的存在。总的来说，该研究确定了瘤内微生物群的特征以及Paraburkholderia fungorum(P. fungorum)在ICC中的抗肿瘤作用。

新格元在该研究中承担了单细胞转录组(GEXSCOPE^®)测序等工作。

下面和元小新一起来看看吧~

研究背景

ICC是一种罕见的恶性肿瘤，该疾病在中国及东南亚地区发病率高，且恶性程度高、预后差。人类的共生微生物群落已被证明可以寄生在人类肝脏和胆管中，它们可以影响肝脏代谢、免疫环境和疾病状态。因此，肝内微生物群如何影响肝脏和胆管疾病的发生、进展和治疗值得进一步研究。该研究旨在通过scRNA-seq等手段阐明ICC组织的细菌宏基因组学特征，并探索其抗肿瘤潜力。

思维导图

研究结果

1.ICC患者不同的微生物组特征

作者收集了52名ICC患者的94份临床样本(配对的肿瘤(T组)和癌旁(P组)组织各42份，加上未配对的3份肿瘤组织和7份癌旁组织)。经过质控，获得了2,320,287个平均长度为413bp的reads，对应于266个物种。其中，丰度较高的细菌包括Burkholderiales、Pseudomonadales、Xanthomonadales、Bacillales、Clostridiales和Sphingomonadales(图1a)。与P组相比，T组中的微生物种类更多(图1b)，且T组中细菌微生物群的Alpha多样性(系统发育多样性)明显高于P组(图1c)。另一方面，三组样本(N组(正常肝脏组)、P组和T组)之间的Beta多样性(不同亚群之间群落组成的相似性或差异)存在明显的差异。然而，相比于N组，P组和T组之间存在很大的相似性(图1d)。

图1 ICC组织中细菌微生物群的组成分析

2.组织中存在活细菌及细胞内的细菌

作者设计了Klebsiella pneumoniae、Pseudomonas azotoformans、Staphylococcus capitis和Paraburkholderia fungorum四种细菌的DNA探针，并将其与ICC的组织切片进行杂交，经HE染色和FISH实验证实ICC组织中存在细菌DNA(图2a)。下一步，作者取新鲜的ICC肿瘤和癌旁组织进行匀浆，然后将组织匀浆涂在平板上，放在恒温器中进行培养。通过孵化，观察到平板中存在菌落，表明肿瘤和癌旁组织中存在有活力的细菌(图2b)。进一步对细菌形态的TEM表征发现，细胞内的细菌存在于肿瘤组织和癌旁组织中，它们可以被包裹在溶酶体中，虽然细菌已经被溶酶体消化，但其轮廓仍然可见(图2c)。

图2 验证性实验表明组织中存在细菌

3.单细胞转录组数据揭示免疫细胞中细菌DNA转录产物的富集程度

为了进一步描绘出细菌在各种细胞类型中的分布变化，作者分析了ICC患者的3个样本(肿瘤、癌旁组织和血浆各1个)的scRNA-seq数据，共得到11,357个细胞用于聚类分析(图3a)。所有细胞被分为11个细胞群，根据marker基因，将这11种细胞类型分别注释为成纤维细胞、内皮细胞、肝细胞、恶性肿瘤细胞和多种免疫细胞(图3b)。与传统的人类scRNA-seq数据分析不同的是，在进行参考基因组比对时，额外纳入了细菌的基因信息，由此得到的结果显示，细菌RNA不仅存在于胆管细胞和肝细胞等实质细胞中，也存在于巨噬细胞和NK细胞等各种免疫细胞中(图3c)。

利用scRNA-seq数据分析了样品中每个细胞的细菌转录产物，结果显示血浆中的细菌在属于白血球的粒细胞中富集。在癌旁组织中，细菌转录产物在T细胞中最为丰富，可能是因为T淋巴细胞会积极参与癌旁组织的免疫反应(图3d)。肿瘤组织中最主要的细胞类型是恶性细胞，主要包括癌变的肝细胞和胆管细胞，因此，肿瘤中的大多数细菌都富集在这种细胞类型中(图3e)。差异性表达结果显示，细菌在癌组织恶性细胞中的含量高于癌旁组织，而细菌在癌组织T细胞中的含量低于癌旁组织。

图3 scRNA-seq分析显示每个细胞类型中都存在细菌RNA

4.临床因素分析显示Burkholderia与CA199水平之间存在负相关关系

接下来，作者收集了患者的临床信息，以探讨肿瘤内微生物丰度与临床因素之间的关系。RDA/CAA环境因素分析显示，癌症抗原CA199对肿瘤组织细菌的影响最大，其次是白蛋白和白细胞(图4a)，这些临床因素中，CA199和白蛋白是正相关的，而CA199与白细胞和高铁血红蛋白是负相关的。瘤内微生物分类和临床因素之间的相关性计算表明，Bacillus anthracis和P. azotoformans的数量与CA199呈正相关(图4b)。相比之下，Burkholderia tuberum和P. fungorum的数量与CA199呈负相关，并与ICC癌旁组织中该细菌的高丰度有关，由此作者推测这两种细菌可能具有抗肿瘤特性。

图4 环境因素分析显示细菌丰度与临床数据的相关性

5.功能预测表明细菌微生物群可能与氨基酸的生物合成有关

基于16S rRNA测序数据，结合eggNOG和KEGG数据库，作者预测了这些细菌的生物功能。结合eggNOG数据库，预测细菌的功能主要涉及代谢，特别是氨基酸代谢(图5a)。类似的，16S rRNA测序数据结合level 2的KEGG功能预测表明，细菌菌落功能主要与碳水化合物的氨基酸和核苷酸代谢途径有关(图5b)。结合level 3的KEGG数据信息，可以进一步确认细菌与氨基酸的生物合成、嘌呤代谢、嘧啶代谢和丙酮酸代谢的关联(图5c)。

图5 细菌微生物群的功能预测分析

6.差异分析显示癌旁组织中Burkholderia的丰度更高

考虑到癌和癌旁组织之间的差异，作者计算了它们不同菌落在物种水平上的特征。在门级水平上，线性判别分析(LDA)结果显示Proteobacteria在癌旁组织中的丰度较高，而Armatimonadetes、Verrucomicrobia和Fusobacteria在癌组织中的丰度较高(图6a)。使用具有高特异性的引物序列，通过RT-qPCR进一步验证了肿瘤组织中Verrucomicrobia DNA是异常丰富的(图6b)。通过qPCR进一步验证了肿瘤组织中Proteobacteria DNA的耗竭(图6d)。在科的水平上，大多数差异性生物在肿瘤组织中表现出较高的水平，包括Comamonadaceae、Staphylococcaceae、Verrucomicrobiaceae、Thiobacteriaceae和Peptococcaceae。在属的水平上，最丰富的细菌在肿瘤组织中表现出高水平，包括Acidovorax、Staphylococcus、Bdellovibrio、Roseimicrobium和Roseburia。在物种水平上，Ralstonia pickettii和Acinetobacter johnsonii的数量最多(图6c)，然而，这两个物种有可能是环境中的污染性细菌。P. fungorum和P. azotoformans在癌和癌旁组织中有显著差异(图6c)，二者在癌旁组织中的含量比在癌组织中的要高。作者由此猜想，癌旁组织中含量较高的细菌对肿瘤的发展有抑制作用，这与P. fungorum的荧光半定量分析结果相似(图6e)。

图6 癌和癌旁组织之间细菌含量的差异分析

7.P. fungorum对胆管癌细胞迁移和增殖的抑制作用

考虑到细菌液的上清液含有大分子和细菌的代谢物，作者以MTT(噻唑蓝)实验、Transwell实验和划痕实验来研究P. fungorum代谢物对癌细胞迁移的影响。Transwell实验的结果表明，加入P. fungorum上清液后，电镜下单位面积的细胞数明显减少，这代表细胞的增殖和迁移能力减弱(图7a)。划痕实验中，加入P. fungorum上清液后，QBC939细胞划痕愈合的百分比明显低于阴性对照样品(图7b)，且划痕愈合率随着细菌上清液浓度的逐渐增加而降低。这些结果表明，细菌上清液抑制了不同类型的胆管癌细胞的迁移，这预示着细菌代谢物中可能存在抑制癌细胞迁移的因素。

接下来，作者在体内实验中研究了细菌对肿瘤表型的影响以及它们可能的功能。作者利用QBC939细胞系，在6周大的裸鼠中构建了一个皮下移植的肿瘤模型(图7c)。除了常规地将肿瘤细胞皮下移植到小鼠体内作为对照组外，还设计了另外三个实验组：肿瘤细胞加活菌、肿瘤细胞加细菌上清液、肿瘤细胞加活菌后在小鼠饮用水中加入抗生素(青霉素和链霉素的混合物)以消减小鼠体内的细菌。体内实验的结果显示，实验组小鼠的肿瘤体积相对于对照组有所减少(图7d)。与对照组相比，实验组中使用活菌的小鼠的肿瘤体积是最低的。在实验组中，从接种到3周，细菌上清液组和抗生素处理组在其体积变化上没有明显差异，不过抗生素组的最终平均肿瘤体积较大。作者还对经活菌处理的实验组小鼠的肿瘤切片进行了不同探针下的FISH实验，验证了小鼠肿瘤中P. fungorum的存在，这也在一定程度上说明了体内实验的准确性(图7e)。

图7 体外和体内试验显示P. fungorum对肿瘤生长的抑制作用

8.移植肿瘤的代谢组学和转录组学表明细菌可能影响氨基酸代谢途径

为了探索细菌对肿瘤的影响，作者收集了小鼠移植肿瘤的样本，并对其进行了基于液相色谱-质谱(LC-MS)的非靶向代谢组学研究。单变量统计分析结果显示，实验小鼠和对照小鼠移植肿瘤中共有380种代谢物存在显著差异，其中上调和下调的代谢物分别有187种和193种(图8a)。

主成分分析结果表明，两组样本数据可以很好地区分开来(图8b), 这表明两组样本之间存在不同的生物学特征。通过对比分析，用P. fungorum治疗移植瘤后，代谢产物2-丙基戊二酸、3-甲基二氧吲哚和二氢叶酸等呈上调趋势(图8c)。上调最显著的代谢物是2-丙基戊二酸和N-乙酰天冬氨酸谷氨酸。接下来，作者对差异代谢物进行了KEGG通路富集分析。结果表明，差异代谢物主要富集在丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢途径中(图8d)。通过将功能预测分析的结果与之前的微生物组数据相结合，发现该通路中N-乙酰基-L-天冬氨酸的数量增加(图8e)，这可能是由细菌作用引起的。

图8 小鼠皮下移植肿瘤的代谢组学分析

结论

①相对于癌旁组织，大多数高含量的细菌在癌组织中的丰度较低。

②在这些差异菌种中，Burkholderia tuberum和Paraburkholderia fungorum在癌旁组织中的含量较高，而且这两种细菌的丰度与临床癌症抗原指标CA199的水平呈现弱的负相关关系。因此，推测该两种细菌的代谢物可能可以抑制肿瘤细胞。

③Burkholderia阻断了肿瘤细胞的迁移，并显著抑制了患有胆管癌的小鼠的移植肿瘤的生长。

④细菌群与氨基酸的生物合成之间存在相关关系，例如与N-乙酰基-L-天冬氨酸的上调呈正相关。

综上所述，ICC中的细菌可能发挥重要的抗肿瘤作用，肿瘤中的细菌丰度与临床因素相关。因此，细菌微生物群的DNA可以作为肿瘤的诊断或预后标志物，甚至作为临床药物治疗的目标。

参考文献

Xiaoqiang Chai, Jie Wang, Huanping Li, et al. Intratumor microbiome features reveal antitumor potentials of intrahepatic cholangiocarcinoma. Gut Microbes. 2022, 15(1):2156255.

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