2023年2月9日，第三军医大学第一附属医院(西南医院)消化内科，胆汁淤积性肝病中心柴进教授团队在国际著名杂志Nature Communications发表了题目为“Unique DUOX2+ACE2+ small cholangiocytes are pathogenic targets for primary biliary cholangitis”的研究成果，该研究利用单细胞转录组测序(scRNA-seq)、空间转录组(ST)、流式细胞分选、多重免疫荧光(IF)等技术，探究原发性胆汁性胆管炎(PBC)发病机制。作者鉴定了一种新型的小胆管细胞-DUOX2+ACE2+小胆管细胞，是PBC发病的主要靶细胞，其含量与疾病的严重程度显著相关，并揭示了DUOX2+ACE2+小胆管细胞上表达多聚免疫球蛋白受体(pIgR)诱导体液免疫应答在DUOX2+ACE2+小胆管细胞受损过程中发挥着关键作用。研究结果表明保护DUOX2+ACE2+胆管细胞可能是PBC治疗干预的有效措施。
新格元在该研究中承担了单细胞、空间转录组测序及数据分析等工作。
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原发性胆汁性胆管炎(PBC)是一种慢性自身免疫性肝病，全世界每年有超过10万例新确诊病例。病理上，PBC最初破坏肝内小胆管中的胆道上皮细胞(BECs)，最终损害其他类型的肝细胞。既往研究表明，遗传和环境因素、免疫功能失调等因素与PBC的发病有关，进行性体液和细胞免疫反应可导致慢性炎症并破坏BECs，但目前尚不清楚自身免疫反应如何破坏PBC患者肝脏中的BECs，以及在PBC发病的早期阶段哪些BECs发生改变。
在这项研究中，作者对4例对照(CTR)以及5例PBC患者的肝手术或穿刺样本进行单细胞转录组测序(包括5'和3'scRNA-seq)，发现在人肝脏中一种独特类型的DUOX2+ACE2+小胆管细胞，并通过荧光激活细胞分选(FACS)、多重免疫荧光(IF)和RNAscope方法进一步鉴定。此外作者通过空间转录组学(ST)和蛋白质组学研究了它们在PBC患者中的功能和临床意义。结果表明，高表达pIgR抗原的DUOX2+ACE2+小胆管细胞是PBC的致病靶点。
1.PBC肝脏单细胞转录组图谱
通过对4例CTR及5例PBC单细胞转录组测序，质控后共获得70,050个细胞，进一步聚类注释，作者鉴定出11种细胞类型。CTR和PBC肝脏的细胞组成存在显著差异。与对照组相比，PBC肝脏中内皮细胞、胆管细胞和间充质细胞的比例减少，而T细胞和浆细胞的比例增加。
图1 肝脏细胞的单细胞转录组图谱
2.人类和小鼠肝脏中发现独特的DUOX2+ACE2+小胆管细胞类型
由于PBC的特点是选择性破坏BECs，作者对胆管细胞进一步细分，鉴定了8个胆管细胞簇，并在人类对照肝脏中鉴定出了一个独特的胆管细胞簇3，而在PBC患者样本中均未检测到该细胞群。胆管细胞簇3以特异性高表达双氧化酶2(DUOX2)和血管紧张素转换酶2(ACE2)，作者推测该细胞群是PBC发病过程中的潜在靶点。接下来，作者使用抗CK19、抗DUOX2和抗ACE2抗体进行FACS分选，并通过RNAscope、多重免疫荧光和qPCR，鉴定了胆管细胞簇3为DUOX2+ACE2+小胆管细胞。
图2 人和小鼠肝脏中独特的DUOX2+ACE2+小胆管细胞鉴定
3.DUOX2+ACE2+小胆管细胞含量降低与胆汁分泌障碍和PBC严重程度显著相关
通过KEGG富集分析发现，DUOX2+ACE2+小胆管细胞显著富集到胆汁分泌通路，提示在PBC发病过程中，DUOX2+ACE2+小胆管细胞可能对胆汁分泌起重要作用。肝脏切片RNAscope和多重IF分析显示，与对照组相比，PBC患者DUOX2+ACE2+胆管细胞数量显著减少并且其减少程度与PBC严重程度显著相关。此外，在AMA-M2阳性或AMA-M2阴性的PBC患者中，肝脏DUOX2+ACE2+小胆管细胞数量显著减少，但在阻塞性胆汁淤积症(OC)、继发性硬化性胆管炎(SSC)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)患者减少不明显。这些数据表明，PBC中肝脏DUOX2+ACE2+小胆管细胞数量显著减少，与胆汁分泌障碍和PBC严重程度显著相关。
图3 DUOX2+ACE2+小胆管细胞在PBC中的功能及临床意义
4.CD27+记忆B和浆细胞聚集在肝门静脉区，并与DUOX2+-ACE2+小胆管细胞互作
PBC是由自身免疫介导胆道损伤引起的，为了研究哪些免疫细胞浸润与DUOX2+ACE2+小胆管细胞损伤有关，作者使用了HE染色、空间转录组学(ST)和多重IF分析了对照组和PBC患者冷冻肝脏切片。ST结果显示，PBC肝切片中B细胞、浆细胞和T细胞比例增加。肝门区ST数据进一步显示，PBC肝门区B细胞和浆细胞浸润明显增加，而单核细胞和NK细胞比例明显降低。进一步的多重IF分析显示，PBC肝门区CD27+记忆B细胞和浆细胞数量明显高于对照肝脏。单细胞BCR测序结果显示，与对照组患者相比，PBC患者的浆细胞克隆扩增明显增加。
图4 CD27+记忆B和浆细胞在PBC患者肝门静脉区聚集
基于CellPhoneDB作者进一步分析了DUOX2+ACE2+小胆管细胞与免疫细胞之间的潜在相互作用。DUOX2+ACE2+小胆管细胞配体和免疫细胞(包括B细胞和浆细胞)表达的受体之间存在显著的相互作用。这些结果表明，PBC发病过程中，免疫应答与肝脏DUOX2+ACE2+小胆管细胞数量的选择性减少有关，也可能通过细胞-细胞相互作用影响其他类型的胆管细胞。
图5 胆管细胞与免疫细胞互作网络
5.PBC患者肝脏pIgR在DUOX2+ACE2+小胆管细胞中高表达，血清抗pIgR抗体水平明显升高
为了研究浆细胞自身抗体与肝脏DUOX2+ACE2+小胆管细胞损伤之间的关系，作者对对照组和PBC患者的血清样本进行了蛋白质组学分析。在2805种定量蛋白中，PBC患者血清蛋白增加了50种，减少了87种。差异蛋白火山图显示PBC患者血清pIgR水平明显高于对照组。同样，PBC患者血清抗pIgR抗体水平也显著升高。对人和小鼠肝细胞的scRNA-seq、RT-qPCR和多重IF分析进一步显示，在DUOX2+ACE2+小胆管细胞中，pIgR mRNA转录物和蛋白质的水平明显高于DUOX2-ACE2-胆管细胞和其他类型的肝细胞。总之，研究结果表明，在PBC中，pIgR特异性自身抗体可能与DUOX2+ACE2+小胆管细胞损伤有关。
图6 pIgR主要在DUOX2+ACE2+小胆管细胞中表达
本研究利用多组学技术，全面探究了PBC发病过程中其细胞水平的特征，鉴定了一种独特类型的DUOX2+ACE2+小胆管细胞并研究了它们在PBC患者中的功能和临床意义。该研究拓展了人们对PBC发病机制的认识，为有效治疗该病提供了潜在靶点。
Xi Li, Yan Li, Jintao XiaoUnique,et al. DUOX2+ACE2+ small cholangiocytes are pathogenic targets for primary biliary cholangitis. Nat Commun. 2023 Feb 9;14(1):29. doi: 10.1038/s41467-022-34606-w.
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