1.在NIID模型中，GGC重复突变可诱导含polyG的核内包涵体形成

为了研究NOTCH2NLC基因5’非编码区GGC重复扩增对人脑的影响，作者对来自3例具有NOTCH2NLC GGC重复扩增的NIID患者(GGCexp)和3个正常对照(GGCnor)的皮肤成纤维细胞进行重编程，并将其分化为3D脑类器官(3DCOs)及细胞模型。免疫荧光结果发现，相较于GGCnor，GGCexp组中有更多SQSTM1泛素阳性核内包体沉积。针对NOTCH2NLC基因上游开放序列(uN2C)的免疫荧光显示，SQSTM1泛素阳性核内包体出现更多的uN2CpolyG共定位。且SQSTM1-21阳性核内包体中，uN2C polyG共定位最多，表明NOTCH2NLC GGC重复序列可以产生含有polyG的蛋白，这些蛋白出现在SQSTM1和泛素阳性的核内包体中。免疫荧光结果还发现重复RNA也存在于NIID的核内包涵体中。作者对90-DIV 3DCOs和30-DIV神经元中的NOTCH2NLC进行了定量，免疫印迹结果显示，NOTCH2NLC在GGCexp和GGCnor 3DCOs中的表达无显著差异。这些结果表明毒性RNA和翻译产物功能获得可能参与了NIID的发病过程。

图1 患者特异性ipsc衍生的3D脑类器官、2D神经元和NIID细胞模型的生成和病理特征

图2 NOTCH2NLC基因GGC重复扩增可在脑类器官和细胞模型中诱导polyG阳性核内包体的形成

2.NOTCH2NLC GGC重复可增加自噬通量，激活整合应激反应(ISR)

SQSTM1是选择性自噬的靶点，被发现广泛地存在于NIID的核内包涵体中。免疫印迹结果显示，GGCexp 3DCOs中SQSTM1表达水平显著降低。自噬标志物LC3B在GGCexp 3DCOs和神经元中的表达显著增加。作者使用溶酶追踪器检测活细胞的溶酶体状态。在GGCexp神经元中发现溶酶-示踪剂标记的酸性成分体积和数量增加。腺病毒的免疫荧光显示GGCexp神经元中自噬小体和自噬溶酶体的数量和体积显著增加，这些结果表明NOTCH2NLC GGC重复可以增强自噬通量。同时作者定量了3DCOs和神经元中ISR标记物的表达水平，发现在GGCexp 表达增加，表明在GGCexp模型中ISR被激活。这些结果表明NOTCH2NLC GGC重复增强了自噬通量，激活了EIF2α-ISR-ATF4通路，从而促进了NOTCH2NLC GGC重复的发病机制。

图3 NOTCH2NLC GGC重复序列可引起自噬通量增加，激活综合应激反应

3.Bulk转录组测序和单细胞测序显示GGC重复序列可能影响核糖体生成及翻译

对NIID患者(GGCexp-1和GGCexp-2)和正常对照(GGCnor-1和GGCnor-2)的30-DIV神经元中进行了RNA测序，GGCexp中的下调基因主要富集在翻译和核糖体结构组成途径中。WGCNA分析发现，富集在翻译、核糖体和核糖体亚单位途径中的模块在GGCexp神经元中表达水平也显著较低。

对NIID患者和正常对照的3DCOs进行了单细胞转录组测序(scRNA-seq)。鉴定出八种细胞类型：成熟神经元(MNs)、未成熟神经元(iMNs)；放射状胶质细胞(RGCs)；神经祖细胞(NPCs)；成神经细胞(NBs)；少突胶质前体细胞(OPCs)；髓鞘化雪旺氏细胞(MSCs)；谷氨酸能神经元(GNs)。

GGCexp 3DCOs显示未成熟神经元(iMNs)比例较低，RGCs比例较高。伪时间轨迹分析结果发现GGCexp 3DCO在发育iMNs时分支更少，轨迹更短，而在发育RGCs时轨迹更复杂，提示NOTCH2NLC GGC重复序列可能影响3DCOs的生长。功能富集分析显示，GGCexp 3DCOs中下调基因主要参与核糖体、细胞质翻译、核糖体结构组成和细胞质核糖体。GGCexp中MNs、iMNs、RGCs、NPCs和NBs中的下调基因在细胞质翻译、核糖体和核糖体结构组成通路中一致富集。GSVA分析发现在GGCexp 3DCOs的主要细胞类型中“核糖体”和“细胞质翻译”基因的富集评分较低，表明在这些细胞中存在翻译和核糖体功能障碍。