2023年2月，郑州大学第一附属医院神经内科史长河、许予明课题组在神经科学杂志Brain发表题为“GGC repeat expansion in NOTCH2NLC induces dysfunction in ribosome biogenesis and translation”的研究成果，该研究构建了神经元核内包涵体病(NIID)患者特异性iPSC细胞系来源的3D脑类器官及细胞模型。结合单细胞测序，揭示了NOTCH2NLC基因GGC重复扩增突变可引起NPM1介导的核仁应激及后续的核糖体生成及翻译功能障碍，最终导致神经元的变性死亡。
新格元在该研究中承担了组织解离、单细胞文库构建及单细胞转录组(GEXSCOPE®)测序等工作。
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NOTCH2NLC基因5’非翻译区(UTR)GGC重复扩增与一系列神经系统疾病相关，尤其是神经元核内包涵体病(NIID)。已有研究报道过NOTCH2NLC基因的GGC重复扩增突变可产生含多聚甘氨酸(polyG)的蛋白，该蛋白参与神经元核内包涵体的形成。但NOTCH2NLC基因GGC重复扩增突变导致神经毒性的机制未明。
1.在NIID模型中，GGC重复突变可诱导含polyG的核内包涵体形成
为了研究NOTCH2NLC基因5’非编码区GGC重复扩增对人脑的影响，作者对来自3例具有NOTCH2NLC GGC重复扩增的NIID患者(GGCexp)和3个正常对照(GGCnor)的皮肤成纤维细胞进行重编程，并将其分化为3D脑类器官(3DCOs)及细胞模型。免疫荧光结果发现，相较于GGCnor，GGCexp组中有更多SQSTM1泛素阳性核内包体沉积。针对NOTCH2NLC基因上游开放序列(uN2C)的免疫荧光显示，SQSTM1泛素阳性核内包体出现更多的uN2CpolyG共定位。且SQSTM1-21阳性核内包体中，uN2C polyG共定位最多，表明NOTCH2NLC GGC重复序列可以产生含有polyG的蛋白，这些蛋白出现在SQSTM1和泛素阳性的核内包体中。免疫荧光结果还发现重复RNA也存在于NIID的核内包涵体中。作者对90-DIV 3DCOs和30-DIV神经元中的NOTCH2NLC进行了定量，免疫印迹结果显示，NOTCH2NLC在GGCexp和GGCnor 3DCOs中的表达无显著差异。这些结果表明毒性RNA和翻译产物功能获得可能参与了NIID的发病过程。
图1 患者特异性ipsc衍生的3D脑类器官、2D神经元和NIID细胞模型的生成和病理特征
图2 NOTCH2NLC基因GGC重复扩增可在脑类器官和细胞模型中诱导polyG阳性核内包体的形成
2.NOTCH2NLC GGC重复可增加自噬通量，激活整合应激反应(ISR)
SQSTM1是选择性自噬的靶点，被发现广泛地存在于NIID的核内包涵体中。免疫印迹结果显示，GGCexp 3DCOs中SQSTM1表达水平显著降低。自噬标志物LC3B在GGCexp 3DCOs和神经元中的表达显著增加。作者使用溶酶追踪器检测活细胞的溶酶体状态。在GGCexp神经元中发现溶酶-示踪剂标记的酸性成分体积和数量增加。腺病毒的免疫荧光显示GGCexp神经元中自噬小体和自噬溶酶体的数量和体积显著增加，这些结果表明NOTCH2NLC GGC重复可以增强自噬通量。同时作者定量了3DCOs和神经元中ISR标记物的表达水平，发现在GGCexp 表达增加，表明在GGCexp模型中ISR被激活。这些结果表明NOTCH2NLC GGC重复增强了自噬通量，激活了EIF2α-ISR-ATF4通路，从而促进了NOTCH2NLC GGC重复的发病机制。
图3 NOTCH2NLC GGC重复序列可引起自噬通量增加，激活综合应激反应
3.Bulk转录组测序和单细胞测序显示GGC重复序列可能影响核糖体生成及翻译
对NIID患者(GGCexp-1和GGCexp-2)和正常对照(GGCnor-1和GGCnor-2)的30-DIV神经元中进行了RNA测序，GGCexp中的下调基因主要富集在翻译和核糖体结构组成途径中。WGCNA分析发现，富集在翻译、核糖体和核糖体亚单位途径中的模块在GGCexp神经元中表达水平也显著较低。
对NIID患者和正常对照的3DCOs进行了单细胞转录组测序(scRNA-seq)。鉴定出八种细胞类型：成熟神经元(MNs)、未成熟神经元(iMNs)；放射状胶质细胞(RGCs)；神经祖细胞(NPCs)；成神经细胞(NBs)；少突胶质前体细胞(OPCs)；髓鞘化雪旺氏细胞(MSCs)；谷氨酸能神经元(GNs)。
GGCexp 3DCOs显示未成熟神经元(iMNs)比例较低，RGCs比例较高。伪时间轨迹分析结果发现GGCexp 3DCO在发育iMNs时分支更少，轨迹更短，而在发育RGCs时轨迹更复杂，提示NOTCH2NLC GGC重复序列可能影响3DCOs的生长。功能富集分析显示，GGCexp 3DCOs中下调基因主要参与核糖体、细胞质翻译、核糖体结构组成和细胞质核糖体。GGCexp中MNs、iMNs、RGCs、NPCs和NBs中的下调基因在细胞质翻译、核糖体和核糖体结构组成通路中一致富集。GSVA分析发现在GGCexp 3DCOs的主要细胞类型中“核糖体”和“细胞质翻译”基因的富集评分较低，表明在这些细胞中存在翻译和核糖体功能障碍。
图4 Bulk测序和单细胞测序显示，NOTCH2NLC基因中的GGC重复扩增可能影响ipsc衍生模型中的核糖体生物发生
4.GGC重复诱导核仁应激，损害核糖体的生物发生，抑制全细胞翻译
在真核细胞中，核仁的主要功能是快速合成大小核糖体亚基，参与核糖体RNA的转录、加工以及核糖体的组装。当核糖体的生成被破坏时，细胞进入核仁应激的状态，而NOTCH2NLC GGC重复序列可能导致编码核糖体蛋白的mRNA表达减少。免疫荧光显示，转染uN2C-23 (GGC)90-mCherry质粒的HEK293T细胞，显示出更明显的NPM1核质易位，提示NOTCH2NLC GGC重复序列可在NIID细胞模型中引起核仁应激和NPM1易位。
rRNA是核糖体生物发生的另一个组成部分。作者通过RT-qPCR检测18S和28S rRNA的表达水平发现其表达水平明显降低。此外，在转染uN2C-(GGC)90-10 mCherry质粒的HEK293T细胞中也显示18S和28S rRNA表达水平显著降低。这些结果表明NOTCH2NLC GGC重复序列可以影响NIID细胞模型中rRNA的表达。转染uN2C-(GGC)90-mCherry质粒的HEK293T细胞的免疫荧光显示更多的mCherry-rRNA包含体，表明核内包体可以在NIID细胞模型中隔离rRNA。
图5 NOTCH2NLC GGC重复序列在NIID细胞模型中可诱导核仁应激和核糖体生成受损
应激颗粒是在细胞应激作用下形成的无膜结构。在NIID细胞模型中可以检测到应激颗粒的形成。在基础条件下，转染uN2C-(GGC)90-mCherry质粒的HEK293T细胞比转染uN2C-(GGC)20-mCherry质粒的HEK293T细胞以及未转染的细胞均表现出更多G3BP1阳性的应激颗粒。然而，应激颗粒的诱导剂处理后，三组间出现应激颗粒的细胞比例无明显差异。这些结果表明NOTCH2NLC GGC重复序列在基础条件下可诱导NIID细胞模型中应激颗粒的形成。同时免疫印迹结果也表明NOTCH2NLC GGC重复序列可以影响蛋白质的合成。
图6 NOTCH2NLC GGC重复序列在NIID细胞模型中可诱导应激颗粒的增强形成，抑制全细胞翻译
本研究揭示了核糖体生成障碍、EIF2α磷酸化及G3BP1阳性应激颗粒形成的增加可能通过抑制全细胞翻译导致细胞死亡，参与神经变性发生。患者iPSC来源的脑类器官单细胞测序示NOTCH2NLC基因GGC重复扩增突变可能影响3D类脑器官发育，导致未成熟神经元的比例更低，揭示了人类特异基因NOTCH2NLC功能变化对神经系统发育的影响。
Yu Fan, Meng-jie Li, Jing Yang, et al. GGC repeat expansion in NOTCH2NLC induces dysfunction in ribosome biogenesis and translation, Brain, 2023;, awad058, https://doi.org/10.1093/brain/awad058
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