1.缺血性AKI患者的临床及肾脏病理特征

本研究中的两名缺血性AKI患者接受了肾活检，主要形态学特征为急性肾小管坏死、肿胀和不同程度的变性，光镜下伴有肾间质炎症细胞浸润，肾小球正常或轻微病变。在一些肾小管中也可以看到管腔扩张、刷状缘丧失和退化的小管上皮细胞脱落到管腔中。免疫荧光未见明显免疫复合物沉积，电镜下观察急性肾小管损伤。两名AKI患者均被诊断为AKI 3期。本研究中2例AKI患者的病因主要为严重腹泻引起的缺血。第一例AKI患者肾活检后10天Scr降至1.23 mg/dL。第二例AKI患者肾活检后7天Scr降至1.12 mg/dL。在半年的随访中，两名AKI患者的Scr水平保持在正常范围内。

图1 缺血性AKI患者肾损害的病理特征

2.人肾皮质组织细胞谱系的分类

作者对2例缺血性AKI患者肾脏样本中的19,715个单个肾细胞进行了测序，还整合并比较了来自公共数据集的两名缺血性AKI患者和三名对照组的结果，使用Harmony算法来处理批次效应。根据聚类和markers基因将所有细胞分成15种肾细胞群：系膜细胞(MES)、足细胞(POD)、内皮细胞(EC)、Henle细胞环(LOH)、近端小管细胞(PT)和远端小管细胞(DT)、来自收集管的主细胞(PC)和插层细胞(IC)、巨噬细胞(MC)、单核细胞(MON)、树突状细胞、B细胞、自然杀伤T细胞(NKT)、平滑肌细胞(SMC)和成纤维细胞。

图2  用scRNA-seq技术测定AKI和对照组肾脏细胞谱系分析

3.缺血性AKI患者PT细胞簇特异性基因表达及富集分析

为了阐明缺血性AKI患者的分子差异，作者比较了缺血性AKI患者和对照组之间主要肾实质细胞的转录变化。PT在对照和缺血性AKI中表现出不同的转录组表型，这反映了缺血性AKI的重要病理机制。PT在缺血性AKI发病机制中上调USP47、RASSF4、EBAG9、IER3、SASH1、SEPTIN7、NUB1等新型促凋亡基因(图3A)。此外，PT高表达内质网应激相关基因，因为长期内质网应激会促进AKI细胞凋亡。自噬相关基因在缺血性AKI患者的PT中升高，这可能是一种保护性反应。有趣的是，参与炎症反应的RIG-1信号在PT中上调，这在缺血性AKI的发病机制中尚未被探讨(图4A-D)。PALM3在缺血性AKI的PT中过表达，提示PALM3在缺血性AKI中的潜在致病作用。此外，作者还在缺血性AKI患者的蛋白水平上证实了IER3、EGR1、SASH1、PALM3、PDIA6等基因的上调，USP47和EBAG9蛋白在肾I/R损伤小鼠中表达升高。因此，PT在缺血性AKI的发生和发展中起关键作用。

图3 缺血性AKI与对照组肾脏不同细胞群的差异基因

 

图4 缺血性AKI与对照组不同肾细胞团的富集分析

 

4.缺血性AKI患者的其他肾脏固有细胞特异性基因表达及富集分析

 

如图4A和C所示，AKI患者的DT显示参与内质网蛋白加工、雌激素信号通路和IL-17信号通路，而在LOH中上调的CTSB、USP47、TMBIM6和CD63等差异基因在蛋白激酶A信号通路、整合素介导的信号通路和内质网应激反应通路中富集。缺血性AKI与对照组的组间对比差异基因分析显示，PC中的差异基因富集于核苷酸结合和寡聚结构域(NOD)样受体信号、IL-17信号和内质网应激反应。此外，缺血性AKI的IC中HIF1A、JAK1和DDIT3的表达升高，这三个基因分别参与Th17细胞分化、il-12介导的信号传导和内质网应激反应。由于从公共对照组获得的肾小球细胞数量很少，作者使用来自两名健康活体供者的肾脏数据集作为对照。如图3B所示，缺血性AKI患者EC中IL-32表达升高，IL-32具有促炎特性，可引发内质网应激，EC上调的基因包括细胞粘附分子SPP1、干扰素诱导因子(IFI6)、细胞凋亡和脂质代谢调节因子(PLIN2)、趋化因子(CXCL14)。在缺血性AKI病人的EC中TM4SF1和补体抑制蛋白CD59的下调。

5.缺血性AKI患者肾免疫细胞细胞簇特异性基因表达及富集分析

目前的研究表明，先天性免疫和适应性免疫都参与了AKI中肾小管上皮细胞的损伤和恢复。在肾小管上皮或EC损伤后不久，AKI发生炎症性白细胞的激活和募集。先天免疫细胞可进一步细分为经典型单核细胞、非经典型单核细胞、巨噬细胞、增殖型巨噬细胞、MC-il1b^high、S100A8^high、MC-IL1B^high、DC-IL1B^high(图5)。AKI患者的巨噬细胞中高表达PDIA3、SPP1、PDIA3在促进氧化应激、炎症和细胞凋亡中起关键作用，SPP1已被证明与巨噬细胞浸润和M2极化相关。诱导免疫细胞趋化和粘附的趋化因子(CCL3、CCL4、CCL4L2和CXCL2)在AKI患者的巨噬细胞中上调。在缺血性AKI患者的单核细胞中显示白细胞募集趋化因子(CCL4、CCL4L2、CXCL14、CXCL12和CXCL3)的表达增加，此外过表达的差异基因如PLIN2、ACSL1和ME1参与PPAR信号通路。缺血性AKI树突状细胞中基因的富集主要参与NF-kappa B信号通路、toll样受体信号通路、IL-17信号通路以及nod样受体信号通路。NKT细胞高度表达炎症调节因子，如PALM3和CD46，负责调节炎症细胞因子的产生和补体激活。此外，B细胞在缺血AKI中表达增加，促进中性粒细胞和单核细胞募集和促进炎症的基因表达（图2C,D）。以上结果表明，浸润性免疫细胞有助于炎症特征的产生，并促进缺血性AKI的炎症期。

图5 缺血性AKI患者和对照组肾脏固有免疫细胞的亚型

 

6.缺血性AKI受试者肾脏的细胞通讯

为了确定缺血性AKI受试者肾脏中不同细胞的细胞间串扰，作者进行了配体-受体相互作用分析(图6A)，缺血性AKI中不同肾细胞簇之间的相互作用在巨噬细胞或单核细胞与肾脏中其他细胞群的相互作用中最为显著。巨噬细胞表达的趋化因子CCL2、CCL5、CXCL1和CXCCL8与EC中的非典型受体ACKR1相互作用，促进单核细胞和中性粒细胞向受损肾脏募集和炎症反应。树突状细胞或巨噬细胞表达的趋化因子包括CCL3、CCL3L1和CCL8与单核细胞表达的受体CCR2和CCR1相互作用，巨噬细胞表达的TNFRSF14可以诱导细胞因子的产生和炎症反应，与MES和LOH中表达的MIF相互作用。单核细胞表达的配体CD44与EC表达的粘附分子SELE相互作用，参与驻留细胞和白细胞的粘附作用。成纤维细胞表达TGFB1、TGFB2和TGFB3，可能通过转化生长因子β(TGF-β)信号通路促进炎症和纤维化，与EC中表达的TGFBR3相互作用。结果还表明，JAG1/Notch信号通过配体-受体相互作用在肾脏不同的细胞簇之间表达。

本研究在缺血性AKI患者和对照组的肾脏中测定了15种不同的细胞簇。损伤的近端小管(PT)表现出促凋亡和促炎症表型。在人类AKI和肾I/R损伤小鼠的肾脏中分别验证了几个枢纽基因的上调。PT高表达的差异基因富集于内质网应激、自噬和视黄酸诱导基因I(RIG-I)信号传导通路。在其他小管细胞中过表达的差异基因主要富集于核苷酸结合和寡聚化结构域(NOD)样受体信号、雌激素信号、白细胞介素(IL)-12信号和IL-17信号通路。肾驻留免疫细胞中的过表达基因与白细胞活化、趋化性、细胞粘附和补体活化有关。此外，配体-受体相互作用分析显示，在缺血性AKI过程中，巨噬细胞和单核细胞与其他细胞之间存在着重要的细胞通讯。

Tang R, Jin P, Shen C, et al. Single-cell RNA sequencing reveals the transcriptomic landscape of kidneys in patients with ischemic acute kidney injury. Chin Med J (Engl). 2023 Apr 20. doi: 10.1097/CM9.0000000000002679. 

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