1.QMID探针的设计与评价

图1 QMID探针的设计与评价

作者合成了可被半乳糖苷酶βGal激活的探针gFQM-biotin和gFMeQM-biotin。利用βGal与ZHER(HER2的纳米抗体)的嵌合蛋白ZHER-βGal选择性地在HER2阳性细胞表面展示βGal，作者证明QMID可以有效地标记HER2阳性细胞的邻近细胞。被标记后的细胞可以使用流式细胞仪或共聚焦荧光成像进行分析。

图2 基于QMID的细胞尺度接近标记

2.巨噬细胞与肿瘤细胞共培养的空间定义基因表达谱

作者随后利用这一技术探究了癌细胞与巨噬细胞的相互作用。利用QMID，作者将癌细胞邻近的巨噬细胞进行了标记、分离和RNA测序。通过与单独培养的巨噬细胞的基因表达进行比较，作者发现巨噬细胞中许多基因表达与巨噬细胞和癌细胞的空间距离相关，并鉴定到PD-L1及IDO1等一系列基因表达在巨噬细胞中受到了邻近癌细胞的激活。

图3 巨噬细胞与肿瘤细胞共培养的空间定义基因表达谱

3.小鼠脾脏中特异性T细胞亚型近端细胞的鉴定

最后，作者将QMID应用于活体组织切片，并探究了小鼠脾脏中不同T细胞亚群的邻近细胞组成。通过生物素修饰的抗体及βGal修饰的链霉亲和素将βGal展示至小鼠脾脏切片中CD4⁺和CD8⁺ T细胞的表面后，作者使用QMID对其邻近细胞进行标记和分离，结合单细胞转录组测序技术成功实现了对小鼠脾脏中两类T细胞的邻近细胞的系统鉴定与分析。

首先，采用流式细胞仪(FACS)分离经QMID标记的小鼠脾脏CD4⁺和CD8⁺ T细胞近端细胞，进行单细胞转录组测序(scRNA-seq)分析。经质量控制后，7082和7795个细胞并鉴定为CD4⁺和CD8⁺ T的近端细胞细胞。在两个近端细胞群中发现了13个细胞簇，包括B细胞、T细胞、DC细胞、NK和phagocytes。表达maker基因Fcsn1的mDCs在靠近CD8⁺ T细胞的细胞群中显著富集。在哺乳动物中APC作为主要类型，DC获得抗原并经历成熟后通过与不同亚型的T细胞相互作用来启动适应性免疫反应。因此，作者分析了两个群中mDCs的基因表达。Cxcr4编码CXC趋化因子受体4(CXCR4)在CD8⁺ T细胞附近的mDCs中高表达，提示mDCs向CD8⁺ T细胞的富集可能受CXCR4信号通路的调控。GSEA分析在CD8⁺ T细胞附近的mDCs上显示了参与脂质分解代谢过程的基因，如Rab7、Sgpl1和Irs2的显著上调。此外，作者发现参与WNT信号通路的基因在CD8+ T细胞附近的mDCs中被激活，如Csnk1a1、Ccnd1和Wnk1。这些结果表明，CD4⁺和CD8⁺ T细胞的近端细胞是特异性组织的，并表现出空间调控的基因表达和功能，这有助于脾脏免疫微环境的细胞空间的构建。