研究背景

研究结果

图S2 ANO1在胃肠道癌症中的表达情况

接着作者选择GC，来评估ANO1的恶性作用。shRNA敲低的GC细胞系AGS/HGC27和CRC细胞系HCT116的ANO1表达显著下调。ANO1敲除后，细胞系体外增殖率显著下降(图2B)，凋亡率升高(图2C)且迁移/侵袭能力减弱(图2D)。这些数据表明ANO1在体外促进GC的恶性进展。对于细胞来源的异种移植(CDX)模型，ANO1敲除导致体内肿瘤生长速率/重量显著降低(图2E)，并降低了移植瘤中增殖标志物Ki67和血管标志物CD31表达(图2F)。为了证实ANO1对体内转移的影响，作者进一步建立了腹腔内注射模型、局部肝转移模型和远端肺转移模型。敲除ANO1导致腹腔(图2G)、肝脏(图2H)、肺(图2I)转移瘤结节数持续减少，提示ANO1促进胃癌生长和转移。

图3. ANO1是胃肠道癌症靶向治疗的可用药靶点

4.ANO1促进免疫抑制肿瘤微环境

对小鼠结肠癌(COAD)细胞株进行了ANO1敲除(图4A)。与免疫缺陷人肿瘤CDXs的结果相比较，ANO1敲除降低了CT26 CDXs的生长(图4B)，同时增加了异种移植肿瘤中CD8/granzyme B的含量，降低了PD-L1表达(图4C,D)，提示细胞毒性CD8+ T细胞在TIME期的浸润增加。根据小鼠CDXs的ELISA检测，在异种移植瘤中IFN-γ/granzyme B/TNF-α/IL-13表达显著升高，而免疫抑制细胞因子IL-4在ANO1敲除后基本保持不变(图4E)。作者还对前面提到的70例胃癌手术病例的主要免疫细胞进行了多重IHC(图4F)，发现ANO1阳性组的CD8+ T细胞浸润明显低于ANO1阴性组(图4G)。因此，ANO1有助于免疫抑制肿瘤微环境，而敲除ANO1可以及时恢复免疫活性。

图4. ANO1形成免疫抑制肿瘤微环境

5.ANO1抑制增强了抗PD-1免疫治疗对胃肠道肿瘤的有效性

由于ANO1敲低可以破坏免疫抑制的肿瘤微环境，作者评估了抑制ANO1对MC38或CT26移植的C57BL-6J/BALB-C小鼠模型中抗PD-1抗体有效性的影响。MC38异种移植瘤对抗PD-1抗体表现出高敏感性(图5A)，而CT26异种移植瘤对抗PD-1抗体表现出低敏感性(图5B)。ANO1敲除(图5A,B)或使用CAI/BBR抑制剂(图5C,D)均可明显增强抗PD-1抗体对MC38/CT26异种移植瘤的抗肿瘤作用。作者还通过抗PD-1抗体对MC38进行长期、低剂量的诱导，建立了MC38- R免疫治疗的获得性耐药(图5E)。作者观察到，与MC38-R CDX的祖细胞MC38 CDX相比，在MC38-R CDX中ANO1的表达升高(图5F)，强调了ANO1参与了抗PD-1免疫治疗的获得耐药性。值得注意的是，ANO1抑制剂CAI也使MC38-R CDX的抗PD-1抗体敏感度提升(图5G)。

图5.抑制ANO1可增强抗PD-1免疫治疗对胃肠道癌症的有效性

6.ANO1通过抑制铁死亡促进肿瘤进展并损害免疫治疗效果

作者对ANO1敲除前、后的HGC27细胞进行了RNA测序。铁死亡通路是富集度最高的信号通路(图6A)。在TCGA-STAD数据集中，抑制铁死亡的两个关键因子NRF2/SLC7A11均与ANO1呈正相关(图6B)，并在ANO1敲低或过表达GC/CRC细胞的蛋白表达水平上得到了验证(图6C,D)。此外，脂质ROS(图6E)和MDA(图6F)，这两种铁死亡的主要特征物质，通过ANO1敲低显著增加而通过ANO1过表达减少，并可通过铁死亡激动剂消除蛋白逆转(图6G,H)。此外，免疫治疗获得性耐药后发现铁死亡抑制因子NRF2/SLC7A11上调(图6I)。

图6. ANO1通过抑制铁死亡促进肿瘤进展，损害免疫治疗效果

7.ANO1通过激活PI3K-Akt信号通路抑制铁死亡

在ANO1敲除后，PI3K-Akt信号通路富集(图7A)。在TCGA的GC数据集(GSE62254)中，GSEA也表明ANO1与激活的PI3K-Akt信号通路相关(基因集M271，图7B)。在GC/CRC细胞中，表明PI3K-Akt信号通路被ANO1下调所抑制，PI3K/AKT/S6的磷酸化减少(图7C)。另一方面，过表达ANO1诱导铁死亡减速因子NRF2/SLC7A11上调(图7D)，脂质ROS/MDA下调(图7E,F)，并可被PI3K-Akt信号抑制剂Dactolisib撤销，说明ANO1通过激活PI3K-Akt信号抑制铁死亡。

图7. ANO1通过激活PI3K-Akt信号通路削弱铁死亡

8.ANO1介导的铁死亡诱导抑制刺激TGF-β的产生和释放，并将癌症相关的成纤维细胞招募到TIME中，产生对免疫治疗的耐药性

在所有关键的微环境细胞中，CAF是唯一一种在所有四种主要GI癌症的TCGA数据集上与ANO1表达一致相关的细胞类型(图8A)。根据先前分析的48例前瞻性GI癌队列中CAF标志物α-SMA的IHC染色，ANO1阳性患者的CAF相对浸润率明显高于ANO1阴性患者(图8B)。根据mIHC分析，在CT26来源的CDX组织中，ANO1敲除降低了CAF的浸润，而增强了CD8+ T细胞的浸润(图8C)。进一步分析CT26 CDX组织中细胞的空间特征，发现敲除ANO1后CAF分布的肿瘤/基质比降低，CD8+ T细胞分布的肿瘤/基质比增加(图8D)。表明ANO1敲除显著诱导CAFs从肿瘤向间质转移，CD8+ T细胞从间质向肿瘤聚集。在GC/CRC细胞中，ANO1敲低抑制TGF-β的表达和分泌(图8E,F)。

图8. ANO1通过促进癌细胞分泌TGF-β来招募CAF

获得性免疫治疗耐药后，MC38/MC38-R CDX组织的单细胞转录组测序发现，浸润性CAFs和ANO1表达比例较高(图9G-I)，CAF生物标志物(PDGFR-α/β/FAP)和TGF-β信号成员SMAD2/3蛋白表达升高(图9J)。提示抗PD-1免疫治疗获得性耐药是由ANO1招募的CAFs诱导的。

图9. 抗PD-1免疫治疗获得性耐药是由ANO1招募的CAFs诱导的

在CT26 CDX组织中，ANO1过表达后CAF生物标志物也持续升高(图10K)。结合ANO1敲除和抗PD-1抗体后，CT26 CDX组织中CAF标记物的表达(图10L)和免疫荧光染色(图10M)均显著降低。在GC/CRC细胞水平上，PI3K-Akt通路抑制剂Dactolisib抑制了ANO1过表达导致的TGF-β上调(图10N)，而ANO1敲低抑制TGF-β表达/分泌的作用被铁死亡抑制剂Fer-1所恢复(图10O,P)，说明TGF-β的产生受ANO1-PI3K- AKT-铁死亡信号轴调控。在CT26 CDX模型中，无论是否接受免疫治疗，ANO1敲除增加了CD8+T细胞的浸润，降低了PD-L1/α- SMA在组织中的分布。而在体内，铁死亡抑制剂利普斯他汀逆转了这些作用(图10Q)。此外，Talabostat(CAF抑制剂)增强了CT26 CDX的免疫治疗，相比于ANO1敲除/FAP抑制剂的双联疗法或ANO1敲除/抗PD-1抗体的双联疗法，ANO1敲除/抗PD-1抗体/FAP抑制剂的三联疗法可以使其抗肿瘤效果最大化(图10U)。考虑到ANO1是CAF的上游启动子，那么在ANO1抑制的情况下，靶向CAF是可以克服免疫治疗耐药性的。ANO1介导的抑制肿瘤的铁死亡会随着时间的推移增强CAF的积累，并进一步与促进ANO1诱导的免疫治疗耐药。

图10. ANO1介导的铁死亡抑制引起TGF-β的释放，并使癌相关成纤维细胞进入TIME，产生对免疫治疗的耐药性

ANO1在GI肿瘤微环境中的功能细节：ANO1通过以PI3K-AKT依赖途径抑制癌细胞铁死亡，刺激癌细胞产生和分泌TGF-β，进而增强CAF募集，削弱CD8+ T细胞介导的抗肿瘤免疫反应，产生免疫治疗的耐药性。本研究为ANO1在胃肠道肿瘤中的作用提供了全面的证据。通过揭示ANO1-PI3K- AKT-铁死亡-CAF调节轴的存在，概述了ANO1在介导肿瘤进展和时间重构方面的功能细节，为胃肠道癌症对免疫治疗的低有效性/耐药性提供了线索，并介绍了ANO1作为一个有希望的抗癌精准治疗靶点。

[1] Z. Lu, H. Chen, S. Li, J. Gong, et al. Jiao, X. Zhang, Z. Peng, M. Lu, Z. Wang, H. Zhang, L. Shen, Tumor copy-number alterations predict response to immune-checkpoint-blockade in gastrointestinal cancer. J Immunother. Cancer 2020, 8, e000374.

[2]F. Jiang, K. Jia, Y. Chen, et al.  ANO1-Mediated Inhibition of Cancer Ferroptosis Confers Immunotherapeutic Resistance through Recruiting Cancer-Associated Fibroblasts. Adv Sci. 2023 Jun 21;e2300881.