重磅出击 | 新格元重构基因集让您的单细胞数据挖掘更上一层楼
发布时间：2023-08-07 10:07:43
海量单细胞转录组测序是分子生物学发现的强大源泉。相较于bulk转录组，在单细胞水平挖掘基因表达谱对后续的数据分析也是一大重要变革。在单细胞数据分析管线中最为璀璨的明珠便是细胞身份与状态的刻画。单细胞数据的细胞注释已逐步形成了一套标准的体系，但对于某些细胞类型的细分，利用传统细胞类型去定义或注释往往会掩盖亚群间的更多的异质性和细胞功能信息，无法充分发挥单细胞测序优势。例如，根据流式分选思路，巨噬细胞在过去通常被注释为M1型和M2型2个大类进行研究比较。但事实上，巨噬细胞具有极高的环境可塑性和异质性，在不同疾病甚至不同器官都存在不同的表型和功能(如促炎、促血管生成、免疫抑制、脂肪代谢、促胞外基质重塑、干扰素响应等)，其免疫功能复杂程度远超M1/M2所能定义的范畴。这种情况下，单细胞研究者们更多的开始采用基于无监督聚类结合差异表达基因的方式对目标细胞进行细分和探索(图1[1][2])，不仅能获得高分辨率的亚型信息和功能，也有助于我们发现新的细胞类型与状态。对于某些细胞目前缺乏已知亚型定义的(如成纤维细胞)，同样可以采取这种方法进行细分。
图1 巨噬细胞传统M1 M2注释与功能注释对比
功能注释通常是根据差异表达基因判断亚群所处的生物学通路或状态。基因的功能信息来源于GO/KEGG或者一些文献资料，数据库中获得的生物学通路信息一般比较广谱，缺乏亚型针对性，且文献检索过程耗时耗力。在此基础上，我们可以建立一些有研究方向或者细胞类型针对性的功能基因集，既能覆盖已知功能，还能紧跟研究热点。对目标细胞进行基因集打分表征，有助于快速鉴定多种细胞亚型在疾病、衰老等研究中的功能，或发现感兴趣的细胞群体和新功能细胞亚型，更有方向性地进行后续数据挖掘，充分地将单细胞测序数据应用于临床转化。下面来让我们看看已发表文献中是如何利用基因集打分对细胞亚群进行功能注释进行临床转化的。
上皮-间充质转化(EMT)使细胞丢失了部分上皮细胞的特性，获得一些间充质细胞的特性，让肿瘤细胞获得了更强的侵袭和脱离能力。高级浆液性卵巢癌的研究中，作者构建细胞增殖(MKI67、HMGB2)，EMT(RGS16、TIMP3、SPARC)，细胞分化(PTBP1、ZNF259、PRPF38A)等基因集，用于对难以细分注释的肿瘤细胞进行打分，发现高EMT评分的肿瘤细胞病人的预后较差[3](图2)。
图2 EMT基因集打分
髓源性抑制细胞(MDSC)主要有粒细胞MDSC(G-MDSC)和单核细胞MDSC(M-MDSC)，具有较强的免疫抑制功能，目前转录组水平还没有marker支持MDSC的鉴定和注释。在小鼠胆管癌模型中，G-MDSCs和肿瘤相关巨噬细胞(TAM)导致免疫检查点(ICB)单药治疗无效，靶向G-MDSC和TAM的双重抑制增强ICB疗效。在人类胆管癌中，通过MDSC基因集打分也发现类似的G-MDSCs亚群，这可能为胆管癌临床治疗提供潜在思路[4](图3)。
图3 MDSC基因集打分
铁死亡(ferroptosis)是一种铁依赖性的，区别于细胞凋亡、细胞坏死、细胞自噬的新型细胞程序性死亡方式。骨关节炎的研究中，作者对患者疾病处的软骨细胞进行单细胞测序，沿着应激和铁死亡的线索，通过功能注释-指定亚群细分-功能注释-指定亚群细分-功能注释步骤发现了C1-3-4高表达铁死亡相关基因。基因富集分析发现该亚群的多条上调通路均含有TRPV1，进一步研究发现TRPV1激活可以改善骨关节炎，是潜在靶点[5](图4)。Bai[6]等也构建铁死亡打分模型进行肿瘤治疗中多维度的评估，得到高铁死亡评分组患者对长春瑞滨更敏感的临床结论，推动精准用药。
图4 铁死亡基因功能注释
T细胞耗竭是指由于长期暴露于持续性抗原或慢性炎症，T细胞逐渐失去效应功能，记忆T细胞特征也开始缺失。人头颈部鳞状细胞癌的研究中，作者对CD8T细胞进行分群，使用耗竭祖细胞(Tpex)和终末耗竭细胞(Tex-term)基因集评分，发现淋巴结中T细胞耗竭祖细胞评分更高，而肿瘤中T细胞终末耗竭评分更高(图5)，结合克隆共享与细胞占比发现Tpex从淋巴结进入肿瘤分化为Tex-term，推测淋巴结是抗肿瘤CD8+T细胞的“储备库”，进一步研究发现抗PD-L1治疗后，局部淋巴结内的树突细胞旁的Tpex激活并分化，但转移淋巴结中并非如此，揭示了免疫检查点抑制剂作用靶细胞[7]。
图5 T细胞耗竭相关基因集打分
根据特定基因集表达情况进行打分，可以帮助我们快速获得目标细胞的一些特殊功能或生物学状态，寻找到临床治疗的切入点和新思路，加快单细胞测序在临床治疗中的转化速度。为此，我们从大量的高分文献中收集了一些被临床研究者们广泛关注的或者发现的有价值的基因(集合)，基于单细胞数据分析经验，对其进行了筛选整合以及目标细胞归类，构建了新格元基因集知识库，包括“肿瘤/上皮细胞相关基因集”、“免疫细胞相关基因集”、“基质细胞相关基因集”等(图6)。
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其中T/NK细胞耗竭评分可以查看肿瘤中T/NK细胞的耗竭程度，针对性使用免疫检查点抑制剂进行治疗；
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T细胞、髓系细胞和成纤维细胞的炎症评分可以揭示自免疫疾病中炎症的机理，针对开发治疗自免疫疾病的药物；
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衰老信号评分可以快速筛选出衰老的细胞亚群用于研究，以揭示机体的衰老机制和开发抗衰老药物；
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干细胞信号和增值能力评分可以表征发育中细胞亚群的分化程度，助力发育机理的研究和发育缺陷疾病的治疗。
图6 新格元基因集内容
快来用新格元基因集去打分吧，帮您快速定义每一个细胞亚群的功能，快速找到临床转化的切入点，推动单细胞时代医疗的发展。
参考文献
[1] Bingsheng Lou, Lei Zeng, Xinbo Gao, et al. A single-cell transcriptomic atlas of the human ciliary body[J]. Cellular and Molecular Life Sciences, 2022.
[2] Lee J S, Koh J Y, Yi K, et al. Single-cell transcriptome of bronchoalveolar lavage fluid reveals sequential change of macrophages during SARS-CoV-2 infection in ferrets[J]. Nature Communications, 2021, 12(1):4567.
[3] Hu Zhiyuan,Artibani Mara,Alsaadi Abdulkhaliq et al. The Repertoire of Serous Ovarian Cancer Non-genetic Heterogeneity Revealed by Single-Cell Sequencing of Normal Fallopian Tube Epithelial Cells.[J] .Cancer Cell, 2020, 37: 226-242.e7.
[4] Loeuillard E, Yang J, Buckarma E, et al. Targeting tumor-associated macrophages and granulocytic myeloid-derived suppressor cells augments PD-1 blockade in cholangiocarcinoma[J].The Journal of clinical investigation, 2020.
[5] Zhongyang Lv, Jie Han, Jiawei Li, et al. Single cell RNA-seq analysis identifies ferroptotic chondrocyte cluster and reveals TRPV1 as an anti-ferroptotic target in osteoarthritis[J]. EBioMedicine, 2022.
[6] Bai D, Feng H, Yang J, et al. Genomic analysis uncovers prognostic and immunogenic characteristics of ferroptosis for clear cell renal cell carcinoma[J]. Molecular Therapy - Nucleic Acids, 2021.
[7] Maha K Rahim, Trine Line H Okholm, Kyle B Jones, et al. Dynamic CD8+ T cell responses to cancer immunotherapy in human regional lymph nodes are disrupted in metastatic lymph nodes[J]. Cell. 2023.
