研究背景

研究结果

图1 GBM中肿瘤微环境重编程的单细胞和空间转录组学

4.SIGLEC9+ TAM来源于单核细胞

为了探索SIGLEC9+ TAM的来源，作者进行了RNA速率分析。结果表明，单核细胞从CD14+单核细胞(C3)向SIGLEC9+SEPP1+ TAM(C2)和SIGLEC9+MARCO+TAM(C9)方向分化(图2i)。值得注意的是，SIGLEC9+MARCO+ TAM在单核细胞趋化途径中表现出富集(图2d)，进一步支持了单核细胞迁移到肿瘤中并逐步分化为SIGLEC9+ TAM的观点。因此，推演出SIGLEC9+MARCO+ TAM可能代表循环单核细胞向SIGLEC9+SEPP1+ TAM分化的过渡状态。利用反卷积将ST和scRNA-seq数据整合，通过推断细胞类型在ST点内的空间共定位，发现SIGLEC9+SEPP1+ TAM或SIGLEC9+MARCO+ TAM与CD14+单核细胞的共定位于同一区域，进一步表明它们来源于CD14+单核细胞(图2j)。

5.SIGLEC9+ TAM在新辅助治疗后积累

SIGLEC9在单核细胞和巨噬细胞中有大量表达，并且发现SIGLEC9在无应答样本中的表达明显高(图3a)。此外，SIGLEC9在SIGLEC9+SEPP1+ TAM和SIGLEC9+MARCO+ TAM上的表达在应答样本中显著降低，提示其具有抑制作用(图3b)。接下来，本文检测了ST样品中含有SIGLEC9+ TAM^-的点的空间分布。Res中SIGLEC9+MARCO+细胞的比例低于Non-res样本，而SIGLEC9+SEPP1+ TAM的分布没有变化。SIGLEC9+MARCO+ TAM主要位于瘤旁区，SIGLEC9+SEPP1+ TAM位于肿瘤核心，支持循环CD14单核细胞的逐步迁移过程，即循环单核细胞首先浸润瘤旁区并分化为SIGLEC9+MARCO+ TAM，然后迁移到肿瘤核心并分化为SIGLEC9+SEPP1+ TAM。

差异基因分析显示，与ICB治疗的Res相比，Non-res中SIGLEC9+SEPP1+和SIGLEC9+MARCO+ TAM表达更高的C1QA、C1QB、CD14和SPP1。在Res中，炎症因子APOE、IL1B、STAT1、T细胞趋化因子CCL3、CCL4和IFN-γ相关的ISG15上调(图3c,d)。值得注意的是，SIGLEC9+ TAM在Res表现出更好的T细胞趋化性，这表明它们可以增强ICB治疗的阳性反应(图3e)。作者还对最近发表的两个GBM scRNA-seq据集进行了交叉研究比较。SIGLEC9+ TAM与新辅助PD-1治疗的GBM数据集中的myeloid_C6亚群相似，都表达免疫抑制基因，如GPNMB、CSTB和MRC1(图3f-h)。在复发性GBM数据集中，SIGLEC9+SEPP1+ TAM与TAM亚群一致表达吞噬/脂质和抗炎基因，SIGLEC9+MARCO+ TAM与缺氧TAMs相似(图3i)，表明SIGLEC9+ TAM的免疫抑制功能。

图3 SIGLEC9+巨噬细胞在新辅助抗PD-1治疗后持续存在

6.SIGLEC9+ TAM与临床中预后不良有关

接下来，本文评估了大量临床队列中的SIGLEC9基因表达。结果发现，在癌症基因组图集(TCGA)GBM队列中，SIGLEC9的表达与OS呈负相关(图4a)。使用CIBER-SORTx反卷积分析33对TCGA数据，以本文的scRNA-seq为参考，发现SIGLEC9+ TAM比例显示与同一队列中的OS呈负相关(图4b)。此外，还使用大量GBM队列生成的组织微阵列，通过免疫组织化学(IHC)评估Siglec-9。结果与预期一致，该队列中高水平的Siglec-9与OS呈负相关(图4c)。

图4 小鼠GBM模型中，SIGLEC9+巨噬细胞与预后不良相关，SIGLEC9缺失影响肿瘤生长

7.Siglece缺失增强了小鼠的抗肿瘤活性

Siglece是小鼠SIGLEC9的同源物，作者使用野生型(WT)和Siglece敲除(Siglece−/−)小鼠进行了反向研究。首先在蛋白质水平上评估了C57/BL6小鼠的Siglec-E表达。WT小鼠在脾和淋巴结中的巨噬细胞、中性粒细胞和单核上高度表达Siglec-E，在DCs上的表达较少，但在T细胞、B细胞或自然杀伤(NK)细胞上几乎没有表达，而Siglece−/−小鼠在所有这些免疫细胞上缺乏Siglec-E的表达(图4e)，同样在肿瘤浸润白细胞中发现了Siglec-E的表达，与接种CT2A胶质瘤细胞的小鼠合成肿瘤的脾脏和淋巴结观察到的表达相似(图4g)。Siglece的缺失明显阻碍了腭内肿瘤的生长(图4h)，从而延长了小鼠的存活时间(图4i)。

由于Siglec-E在其他髓系细胞上表达(图4d-g)，使用CSF1R单克隆抗体阻断，致巨噬细胞消融并消除肿瘤中的TAM浸润后，发现巨噬细胞的耗竭完全消除了缺乏Siglece小鼠的肿瘤生长抑制(图4j)。此外，与单独Siglec-E敲除相比，携带肿瘤的Siglece−/−小鼠在CSF1R+巨噬细胞耗尽时的存活率显著下降。为了进一步排除Siglece−/−小鼠的非特异性缺失因素，培养了骨髓源性巨噬细胞(BMDM)转移到肿瘤携带肿瘤的小鼠中。移植的Siglece−/− BMDMs阻碍了WT肿瘤小鼠的肿瘤生长和小鼠的延长了小鼠的存活时间(图4k,l)。相比之下，与WT BMDCs相比，转移的Siglece−/−骨髓源性DCs(BMDCs)对肿瘤生长的影响没有不同(图4m,n)。这些结果表明，在小鼠GBM模型中，表达Siglece的巨噬细胞是介导肿瘤根除的主要细胞群。

8.Siglece缺失会激活巨噬细胞和T细胞

接下来，作者使用scRNA-seq分析评估了Siglece-/-小鼠的颅内肿瘤微环境(图5a)。Siglece-/-小鼠的肿瘤中巨噬细胞、T细胞、NK细胞和DC免疫细胞大幅增加(图5b)。巨噬细胞抗肿瘤反应的基因的表达上调，包括趋化因子Ccl3、Ccl4、Ccl5、Ccl7、Ccl8、Ccl9、Cxcl9和Cxcl10，它们招募和激活细胞溶解性T细胞，以及IFN-γ刺激的基因，如Isg15(图5c)，T细胞在颅内Siglece-/-肿瘤中表达的Il2、Il17a和Ifng水平高于WT(图5d)。FACS分析还显示，与WT相比，Siglece缺失时，CD45⁺细胞、髓样细胞和淋巴细胞的浸润显著增加，这与scRNA-seq分析一致(图5e)，这些结果还通过RT-PCR分析得到了验证(图5f)。接下来，分析了肿瘤内巨噬细胞，发现Siglece-/-巨噬细胞中CD80和MHC-II等活化标志物的表达增加(图5g)。与CT2A细胞共同培养Siglece-/- BMDMs显著增加了趋化因子的表达，包括Ccl4、Ccl8和Cxcl9(图5h)。

图5 Siglece的缺失导致免疫细胞浸润增强，巨噬细胞和T细胞活化

研究发现，当与CT2A细胞共同培养时，BMDMs中的Siglece缺失显著增加了Il4和Il10的表达。虽然Pd-l1表达随着Siglece的缺失而增加，但它在共同培养后仍然与WT BMDM相似(图5i)。两个相左的结果表明，由Siglec-9耗尽引发的抗肿瘤功能更有可能通过免疫激活来介导，而不是通过缓解的免疫抑制来介导。

接下来的问题是Siglece的敲除是否可以优先启动T细胞激活。Siglece-/- BMDM分别显著增加了OT-II或OT-I转基因小鼠增殖性CD4⁺和CD8⁺ T细胞的比例(图5j,k)。Siglece敲除小鼠的肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)也显示激活标志物的表达增加，如CD107a、IFN-γ和Ki67(图5l)。此外，还发现在WT小鼠皮下肿瘤生长期间，巨噬细胞上Siglec-E的表达增加，而不是DCs的表达(图5m)。这一结果进一步支持了负反馈回路的存在，其中Siglece可以作为巨噬细胞的免疫检查点防止免疫系统的过度反应。

9.Siglece-/-与T细胞合作抑制GBM生长

为确定SIGLEC9+ TAM是否与CD4⁺或CD8⁺ T细胞一起清除小鼠GBM肿瘤，作者使用抗体耗尽WT和Siglece-/-荷瘤小鼠的CD4⁺或CD8⁺ T细胞。结果与之前相似，虽然Siglece敲除抑制了肿瘤生长，但Siglece-/-小鼠的CD4⁺ T细胞枯竭显著降低了肿瘤生长抑制，并导致肿瘤生长速度与WT小鼠相似(图6a)。值得注意的是，Siglece-/-或WT小鼠的CD8⁺ T细胞耗尽导致无法抑制肿瘤生长，Siglece缺陷小鼠加速了肿瘤生长，这表明Siglec-E可能以CD8⁺ T细胞细胞毒性依赖的方式介导肿瘤排斥(图6b)。结果表明，靶向Siglece可减轻Siglece+ TAMs的免疫抑制特性，并且该结果是由CD4⁺ T细胞和CD8⁺ T细胞介导的。

图6 靶向Siglece+巨噬细胞与T细胞协同抑制肿瘤生长，Siglece+/SIGLEC9+巨噬细胞与T细胞存在空间关联

10.SIGLEC9+ TAMs直接与GBM中的T细胞相互作用

对WT或Siglece-/- BMDM进行共同培养T细胞迁移进行评估。Siglece-/- BMDM显著增强了CD4⁺ T细胞和CD8⁺ T细胞的迁移(图6d)。将SIGLEC9+ TAM和T细胞相互作用与scRNA-seq和ST数据关联，对ST数据中CD68⁺SIGLEC9+细胞和T细胞共定位分析显示，Res中TH1和共刺激特征增加(图6e,f)。多重免疫组化显示，在Res中，CD68⁺SIGLEC9+细胞在空间上更接近CD8⁺PD-1⁺ T细胞(图6g,h)。同样，ST数据中CD68⁺SIGLEC9+细胞和CD3⁺PDCD1⁺ T细胞之间的空间距离在Res中比Non-res更接近(图6i)。scRNA-seq数据显示，SIGLEC9+ TAM通过CCL4-CCR5、CCL3-CCR5、SPP1-CC8、CD40-CD40L和4-1BBL-4-1BB等多个互作对与T细胞相互作用(图6j)。这些相互作用在小鼠GBM中发现，并且Siglece敲除后得互作更增强，支持巨噬细胞与T细胞互作是Siglec-9/Siglec-E依赖性的(图6k)。

11.Siglece缺失增强了抗PD-1/PD-L1治疗的疗效

作者试图验证Siglece缺失诱导的炎症肿瘤微环境是否可以与ICB治疗协同抗肿瘤。WT或Siglece-/-小鼠颅内接种CT2A胶质瘤细胞，然后用抗PD-1或抗PD-L1抗体治疗(图7a)。与不治疗相比，治疗后的生存期显著延长(图7b,c)。接下来，作者用由Siglec-E胞外结构域重组蛋白治疗患肿瘤的小鼠，该蛋白融合到小鼠IgG2a Fc结构域(Siglec-E-Fc)，并观察到与IgG治疗相比融合蛋白治疗后存活时间较长(图7d,e)。

因此作者提出，Siglec-E-Fc可以与肿瘤细胞膜上的唾液酸化蛋白或游离唾液酸化蛋白结合，从而与巨噬细胞上的内源性Siglec-E竞争结合位点，以阻断Siglec-E信号传导(图7f)。结合本文结果和最近的一项研究表明，针对Siglec-9的阻断抗体可以大大减轻肿瘤负担，并提高人源化小鼠B16黑色素瘤抗PD-1治疗效果。

图7  Siglece的缺失增强了ICB治疗的疗效，是GBM治疗的潜在靶标

在这项研究中，主要利用scRNA-seq和ST来分析GBM的进展，并确定影响抗PD-1治疗反应的因素。数据表明SIGLEC9+巨噬细胞是免疫抑制功能的主要驱动亚群。在小鼠GBM模型中，靶向Siglece巨噬细胞可以抑制免疫功能，增强抗PD-1/抗PD-L1的治疗效果。因此，使用T细胞和巨噬细胞免疫检查点抑制剂联合治疗具有临床应用潜力。最近的研究表明，Siglecs可能作为形成免疫抑制肿瘤微环境的免疫检查点，并且Siglecs可能代表癌症免疫治疗的潜在靶点。本文的研究阐明了靶向GBM中关键SIGLEC9+ TAM的临床潜力，并为巨噬细胞免疫检查点提供了新的见解。此外，scRNA-seq和ST数据联合为了解不同治疗方案后GBM肿瘤微环境的动态提供了丰富的数据资源。

Mei, Y., Wang, X., Zhang, J. et al. Siglec-9 acts as an immune-checkpoint molecule on macrophages in glioblastoma, restricting T-cell priming and immunotherapy response. Nat Cancer (2023). https://doi.org/10.1038/s43018-023-00598-9