项目文章|新格元单细胞技术揭示人类梗阻性和非梗阻性无精子症的转录变化
发布时间：2020-10-22 10:57:47
9月28日，南通大学医学院孙斐老师课题组在学术期刊《Genes & Diseases》发表了题为“Human obstructive (postvasectomy) and nonobstructive azoospermia–insights from scRNA-Seq and transcriptome analysis”的研究文章。
文章采用新格元生物科技有限公司GEXSCOPE®海量单细胞转录组测序技术，首次发现非梗阻性无精子症中具有巨噬细胞、肌样细胞和间质细胞。同时文章还发现在非梗阻性无精子症中存在支持细胞，这是由于GEXSCOPE®单细胞测序技术可以完成体积较大的细胞类型的分离，如支持细胞等，因此在研究内容上增添了更多的信息。
研究背景
精子发生包括一系列高度协调的细胞事件。这些微妙的过程可能会受到遗传疾病的干扰导致男性不育。男性不育(约10-15%)伴有无精子症,包含非梗阻性无精子症(NOA)和梗阻性无精子症(OA)。人类睾丸组织具有高度异质性，单细胞RNA测序在单细胞水平上解析转录组图谱，可以阐明睾丸中的细胞类型异质性。
研究思路
主要研究内容
1）健康人、OA和NOA成人睾丸细胞类型及分布
将本研究中scRNA-Seq数据与公共数据集(健康人，NOA.a)整合分析。聚类分析鉴定出未分化的精原(Undiff S.gonia)、分化的精原(Diff S.gonia)、精母(S.cells)、圆形精子(RS)、细长精子I(ES I)、细长精子II(ES II)、支持(SC)、间质(LC)、睾丸巨噬(TMΦ)和内皮细胞(EC)等。NOA.1只有体细胞，NOA.1可能表现为仅支持细胞综合征(SCOS)，揭示scRNA-Seq对NOA的分类可能与组织病理学吻合；NOA.a有少量分化的精原细胞和精母细胞，可能表现为成熟停滞(MA)。OA患者的睾丸细胞亚型与健康人相同，其睾丸精子比例明显降低，早期初级精母细胞比例明显升高，说明OA患者精子发生功能受损。
图1 人类睾丸的单细胞转录组分析
2）NOA睾丸的支持细胞表现出明显的转录特征
差异表达(DE)分析表明，几个涉及细胞连接和焦点黏附的基因(SYNE2、ATP2B1和MTDH)在NOA.1中下调，在抗凋亡过程中起作用并可能促进生殖细胞发育的FATE1在NOA患者中上调；INHBB编码一种参与抑制素B形成的蛋白，在NOA.1和NOA.a中的表达都极低，与临床发现一致，即在生精衰竭患者中，INHB水平降低，而FSH水平升高。
图2 人类睾丸的单细胞转录组分析
3）OA睾丸的生殖细胞显示明显的转录变化
整合分析2个输精管结扎术男性睾丸的公共scRNA-seq数据集与健康人数据，与我们早期的研究结果一致，OA患者睾丸中RS、ESI和ESII的比例明显低于健康人，而未分化的精原细胞的比例显著增加。进一步对生殖细胞(未分化的精原细胞、分化的精原和精母细胞)和龛细胞(间质细胞、ptmc、内皮和巨噬细胞)进行差异分析(DGE)。数以千计的基因在这两种情况下差异表达，表现出显著的转录变化。
图3 健康与梗阻(输精管结扎后)睾丸标本的单细胞转录组分析
4）共同梗阻信号的鉴定
几个DEG在多种细胞类型之间是共享的。为了研究梗阻条件的总体影响，区分了上述差异分析中趋势一致的90个DGEs。在这些基因中，大多数是核糖体蛋白(RBP)基因(如RPS17)。GO分析如“蛋白质靶向内质网”和“核转录mRNA分解代谢过程”显著富集。发现仅在3组生殖细胞中发生改变的基因，REC114的下调，表明生精动力学受损。
图4 共同梗阻信号的鉴定
5）OA睾丸在生殖细胞中表现出与疾病相关的原型
探索生殖细胞在受阻时发育的动态和调节变化，观察到祖细胞标志物NANO的下调，维持未分化干细胞状态的关键调控因子ID4的表达显著上调，揭示未分化精原细胞表现出较少的祖细胞能力和较强的再生能力，为OA患者睾丸中未分化精原细胞数量的增加提供了解释。精原细胞的分化过程中发现减数分裂起始标记(MEIOB、SYCP3及SYCE1等)下调。这些基因中任何一个丢失都会导致减数分裂完全停止，导致无精子症。
图5 生殖细胞对受阻的细胞类型特异性反应
6）OA睾丸基因调控网络分析
障碍驱动基因的表达变化影响睾丸体细胞之间的细胞通讯，从而间接影响生殖细胞的发育。本文强调4条主要的途径(血小板衍生生长因子、Hhedgehog(HH)信号、雄激素信号及维甲酸)，它们在睾丸的发育、调节和维持中起着重要的作用。数据表明这些变化可能协同或单独地调节发生在睾丸中与梗阻相关的过程。
图6 4条主要途径的关键基因的小提琴曲线图
研究结论
1.鉴定出以往未报道的NOA睾丸的巨噬细胞、肌样细胞和间质细胞。
2.NOA.1样本中只发现了体细胞，表明SCOS的存在。
3.观察到OA个体和健康个体之间生殖细胞群体的差异。
4.确定了在多种细胞类型之间共有的表达变化，这些变化可能被用作未来临床诊断的阻塞性信号。
参考文献
Shitao Chen, Geng An, Hanshu Wang, Xiaolong Wu, Ping Ping, Longfei Hu, Yunmei Chen, Jue Fan, C. Yan Cheng, Fei Sun.Human obstructive (postvasectomy) and nonobstructive azoospermia – insights from scRNA-Seq and transcriptome analysis.Genes & Diseases.
