1.构建纳米平台双靶标治疗方法
近年来，由金属/金属团簇和有机配体构建的金属-有机骨架(MOFs)因其多孔结构和多功能化，且智能MOFs可以响应外部刺激，如pH值、光或温度，从而在受控的药物输送系统中实现刺激反应性释放而受到广泛应用。其中，沸石咪唑酸酯框架(ZIF8)是目前应用最广泛的pH敏感型药物传递体系MOF。在酸性环境下药物释放。作者报道了一种双靶向纳米平台，通过恢复巨噬细胞生态位来治疗RA(图1)。首先将CRIg−CD59包被到ZIF8纳米颗粒中；然后在ZIF8表面涂覆羟基磷灰石(HA)层，防止其在酸性环境中快速分解，实现CRIg−CD59的持续释放。将唑来膦酸(ZA)接枝到HA修饰的ZIF8纳米颗粒表面，以靶向递送骨矿物质并抑制骨吸收。在关节中释放CRIg−CD59后，CRIg对C3裂解产物的靶向活性使重组蛋白能够到达补体活化的细胞表面，CD59竞争性地抑制C5b-8和C9的结合，从而抑制MAC的形成和补体级联反应。此外，CRIg与C3切割产物的竞争性结合可以抑制补体和非特异性免疫的串导，抑制TNF-α、IL-1和IL-6等炎症因子的产生。通过单细胞数据还发现，补充CRIg可以促进VSIg4+生态位印迹巨噬细胞的更新，并恢复巨噬细胞屏障的完整性。总的来说,体外和体内实验结果表明，制备的ZIF8@CRIg−CD59@HA@ZA纳米颗粒为RA治疗提供了一种很有前景的治疗策略。
图1：基于金属-有机框架的双靶向纳米聚合物治疗类风湿关节炎的组装工艺和治疗机制
2.类风湿关节炎的生态位和细胞特征变化
为了研究生态位变化对RA滑膜巨噬细胞的影响，从已发表的数据集GSE134420中获得了滑膜CD45+CD11b+Ly6G-单核巨噬细胞的单细胞测序数据(图2)。通过计算得到VSIg4、C4b、ACP5、CTSK、ATP6V0d和C-FOS等显著差异基因参与细胞活化、细胞粘附调节、细胞外基质组织等关键的生物学功能，并且KEGG通路分析揭示了补体和凝血级联在RA中的中心位置(图2)。通过PaGenBase数据库进行的细胞特异性GO分析揭示破骨细胞显著的富集倾向，进一步探讨了补体与关节生态位印迹巨噬细胞之间的关系：倾向于激活破骨细胞并介导骨基质重塑。
3.ZIF8@CRIg−CD59@HA@ZA治疗可显著改善大鼠类风湿性关节炎
受到ZIF8@CRIg-CD59@HA@ZA具有骨靶向能力和按需持续释放蛋白的启发，评估了该复合物在AIA大鼠模型中的联合治疗效果(图3)。在用完全弗氏佐剂免疫大鼠脚垫14天后，将模型组中的大鼠随机分组治疗。从免疫开始定期测量后肢体积和关节炎评分。尤其是ZIF8@CRIg−CD59@HA@ZA不仅在第35天减缓了后爪的肿胀，而且在微型计算机断层扫描(micro-CT)图像上显示出良好的骨骼完整性，与健康大鼠的图像相当(图3)。这在其他治疗组中没有观察到。地塞米松作为一种经典的抗风湿病药物，也表现出良好的抗炎活性，如后爪体积和关节炎评分较低。
图3：RA建模及治疗时间点；ZIF8@CRIg−CD59@HA@ZA治疗AIA的机理图
4.单细胞测序结果揭示了ZIF8@CRIg−CD59@HA@ZA治疗RA后巨噬细胞生态位景观的恢复
从3只AIA大鼠和3只AIA诱导后ZIF8@CRIg−CD59@HA@ZA大鼠(以下简称MOF组)的关节组织细胞进行了scRNA-seq测序。联合分析注释后获得了胶质细胞、内皮细胞、成纤维细胞、壁细胞、B细胞、浆细胞、TandNK细胞、中性粒细胞、MPs和红细胞，与AIA组相比MOF处理组MPs和TandNK细胞亚型的比例显著下调。根据标记基因的表达定义特异性细胞簇(图4)。且MOF组中下调的差异基因主要富集在免疫调节相关通路，如抗原加工和递呈、BP中对干扰素的反应、CC中MHC蛋白复合物、MHC II类蛋白复合物、MF中T细胞受体结合和细胞因子受体结合的调节、且在破骨细胞中富集，参与TNF信号通路等炎症途径(图4)。单细胞结果与体内实验结果一致，并且表明ZIF8@CRIg−CD59@HA@ZA主要通过抗炎和抗破骨细胞机制干预RA的病理过程。
图4：单细胞数据大类注释结果及差异基因功能富集分析
5.纳米平台治疗RA后巨噬细胞生态位
作者进一步分析了MPs内的细胞簇，并确定了四种亚型：增殖细胞、巨噬细胞、单核细胞和DCs。研究观察到巨噬细胞是MPs中最丰富的亚簇(AIA组为70.48%，MOF组为54.36%)，并且在AIA组中巨噬细胞簇的比例显著降低。根据标记基因的表达来定义特定的细胞簇，并进行热图分析以显示巨噬细胞簇中基因的总体差异表达(图5)。基于M1样和M2样巨噬细胞标记物的表达，使用无监督聚类将巨噬细胞集群进一步细分为5个亚型(巨噬细胞_1-5)。作者发现这些亚型在AIA组和MOF组之间的比例有显著差异(图5)。
无监督聚类将表达IL1b、IL6和TNF的细胞鉴定为M1样巨噬细胞，表达Mrc1和Cd163的细胞鉴定为M2样巨噬细胞(图5)。因此，作者将巨噬细胞_1和巨噬细胞_4区分为M1样巨噬细胞，其中巨噬细胞_1的比例在MOF组明显降低。巨噬_2、巨噬_3、巨噬_5均为M2样巨噬细胞，MOF组3种亚型数量均显著增加。作者使用功能评估基因集评分来表征这些巨噬细胞亚型。干扰素刺激和促血管生成评分提示巨噬_1和巨噬_4对RA炎症反应和血管生成有较强的促进作用，进一步促进RA病理。有趣的是，巨噬_2、巨噬_3和巨噬_5在tissue_resident_like评分中得分明显较高，表明它们可能是组织常驻M2样巨噬细胞亚型(图5)。对巨噬_1和巨噬_4的KEGG分析显示，显著下调的基因主要集中在破骨细胞分化、补体、凝血级联和一些抗炎途径，表明纳米平台治疗确实通过M1巨噬细胞抑制了研究中发现的RA的两种核心分子病理(图5)。鉴于MOF组在M2样巨噬细胞中巨噬_2的上调最为显著，作者鉴定了巨噬_2亚型的差异表达基因。GO分析显示，上调的差异表达基因主要富集于细胞外基质重塑和免疫调节。巨噬_3中上调的基因在细胞骨架修复和炎症调节中也富集。上述结果提示ZIF8@CRIg−CD59@HA@ZA治疗可通过抑制M1样巨噬细胞的浸润和功能，促进M2样组织巨噬细胞的增殖和抗炎修复功能来达到治疗RA的效果。
图5：巨噬细胞亚群细分基因集评分以及功能富集
6.VSIg4+细胞的异质性
VSIg4在整体聚类中的UMAP投影主要映射到MPs区域，整体表达差异小提琴图显示VSIg4在MOF组中普遍高表达(图6)。VSIg4在MPs亚型中的继发UMAP投射主要映射到巨噬细胞亚型， MOF组中VSIg4在MPs亚型中也有高表达的趋势。考虑到ZIF8@CRIg−CD59@HA@ZA可能促进巨噬细胞中特定细胞簇中VSIg4的表达，作者分析了巨噬细胞_1−5中差异表达的基因，发现MOF处理后，巨噬细胞中VSIg4的表达显著上调，这与在组织常驻M2样巨噬细胞中检测到的VSIg4表达一致(图6)。最后，作者对VSIg4+细胞亚型中的上调基因进行了GO富集分析，结果显示，高表达基因主要富集于调节炎症反应、细菌防御反应、蛋白定位到细胞外区域；表明ZIF8@CRIg−CD59@HA@ZA通过促进VSIg4+巨噬细胞的免疫防御和组织修复功能介导了RA的治疗作用(图6)。
图6：VSIg4+细胞的异质性以及基因表达和富集通路
