1.CCI大鼠在脊髓中产生疼痛反应和衰老样表型
与假手术组(sham组)大鼠相比，CCI组大鼠机械刺激缩足反射阈值(PMWT)和热刺激缩足反射潜伏期(PTWL)明显降低(P＜0.001)。此外，CCI组各种促炎细胞因子(IL-1α、IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-8)的蛋白表达水平较sham组增加，提示神经炎症表型增加。
为了证明衰老样表型由周围神经损伤引起的假设，研究了脊髓组织中细胞衰老的几个分子特征。首先，使用SA-β-Gal染色(一种典型的细胞衰老鉴定方法)评估脊髓衰老，CCI组大鼠中SA-β-Gal阳性区域的比例远高于sham组(P=0.002)，此外，CCI诱导脊髓衰老也通过一些衰老分子标志物(P16和γ-H2AX表达水平提高(P<0.001)得到证实。
图1：坐骨神经慢性缩窄性损伤(CCI)的大鼠表现出爪子机械抽离阈值(PMWT)和爪子热缩组潜伏期(PTWL)反应，炎症细胞因子过度产生和细胞衰老样表型
2.CCI诱导的细胞衰老主要出现在脊髓星形胶质细胞
为了确认CCI后大鼠脊髓中衰老细胞的定位，进行了双重免疫荧光染色。CCI脊髓切片中P16阳性和γ-H2AX阳性(P<0.001)细胞大部分在星形胶质细胞(GFAP)，少部分在神经细胞(NeuN)和小胶质细胞(IBA1)。结果表明，周围神经损伤引起的衰老主要表现在脊髓星形胶质细胞中。
图2：脊髓背角同侧坐骨神经CCI和sham的P16双染色及定量分析
图3：脊髓背角同侧坐骨神经CCI和sham的γ-H2AX双染色及定量分析
3.星形胶质细胞衰老促进促炎细胞因子的分泌
脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)是炎症模型构建的诱导剂，可以通过诱导促炎介质的生成促进神经炎症反应，过氧化氢(Hydrogen Peroxide, H2O2)是一种氧化剂,可通过诱导氧化应激来引起细胞衰老。研究LPS和H2O2(一种广泛使用的细胞衰老诱导剂)对星形胶质细胞的影响。在星形胶质细胞培养物中，与对照(Con)细胞，用LPS或H2O2处理后表达SA-β-Gal(衰老标志物)的细胞比例增加。此外，Western bolt验证LPS与H2O2对衰老分子标志物(P16和γ-H16AX)表达水平的有一定的促进作用。Western bolt验证LPS或H2O2处理后的星形胶质细胞衰老相关分泌表型(SASP)相关的基因(IL-1α、IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-8)表达明显更高。结果表明，体外实验LPS可以诱导大鼠脊髓星形胶质细胞的衰老表型，然后表现出炎症性SASP的典型特征。
图4：H2O2和LPS诱导原代培养的衰老和炎症细胞因子过量产生脊髓星形胶质细胞
4.抗衰老药物治疗抑制星形胶质细胞衰老并缓解疼痛行为
36只大鼠随机分为以下四组(n=9)：sham组，CCI组，CCI+veh组(空载体组)和CCI+DQ组(达沙替尼和槲皮素联合给药处理组)，DQ药物是临床上有效的抗衰老组合药物，研究抗衰老治疗对衰老星形胶质细胞的影响。
SA-β-Gal染色结果显示：DQ治疗72小时后，LPS诱导的星形胶质细胞衰老比例显著降低；Western blot和免疫荧光染色显示：用DQ处理星形胶质细胞降低了P16和γ-H2AX表达水平；衰老星形胶质细胞中关键的细胞衰老相关分泌表型(SASP)因子降低。
图5：DQ延缓原代培养的脊髓星形胶质细胞衰老
图6：DQ降低体外衰老的脊髓星形胶质细胞的炎症细胞因子水平
CCI大鼠术后第五天开始，与Veh组相比，DQ组显著改善了PMWT和PWLT的降低；DQ处理的CCI大鼠SA-β-Gal染色衰老细胞比例、P16和γ-H2AX表达水平显著降低，免疫荧光实验显示：口服DQ可逆转CCI大鼠脊髓星形胶质细胞(GFAP)中的P16增加；Western bolt结果表明，抗衰老药物DQ抑制了响应CCI的SASP表型(IL-1α、IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-8)的分泌。以上结果说明抗衰老药物可以保护CCI大鼠免受周围神经损伤诱导的痛觉超敏反应和星形胶质细胞衰老。
图7：DQ抑制衰老，减轻CCI诱导的疼痛、星形胶质细胞衰老和脊髓炎症
5.单细胞转录组测序鉴定与脊髓星形胶质细胞衰老相关的内在分子反应
接下来，对大鼠对照组(con)脊髓组织和神经病理疼痛模型(CCI)脊髓组织进行单细胞测序，鉴定出星形胶质细胞、Bcell、内皮细胞、室管膜细胞、软脑膜细胞、小胶质细胞、壁细胞、髓系细胞、少突胶质前体细胞、少突细胞、施万细胞、Tcell等，后续对关注的对照组95个星形胶质细胞和实验组131个星形胶质细胞进行了组间差异分析，筛选到40个差异基因，差异基因进行GO、KEGG富集分析，GO富集分析富集到生物学过程：中间纤维细胞骨架组织通路、细胞组分：远端轴突和神经丝通路、分子功能：肌动蛋白结合和蛋白N末端结合通路；KEGG富集到参与局灶性粘连、血管平滑肌收缩和突触囊泡循环通路。
将差异基因与衰老相关基因(SRG)取交集，MALT1、ENO1、CLU和LDHB被定义为DE-SRG。进行Western bolt发现相比对照组，LPS与星形胶质原代细胞共培养后MALT1、ENO1、CLU和LDHB均上调，但仅在达沙替尼和DQ治疗后观察到CLU蛋白水平显著降低，这表明星形胶质细胞中CLU的激活可能与衰老有关。
图7：单细胞转录组测序揭示了大鼠神经性疼痛模型脊髓星形胶质细胞的谱图和转录变化
