项目文章Nat.Commun. | 单细胞测序联合微生物组揭示胰腺损伤与中性粒细胞胞外捕获网形成新机制

发布时间：2023-10-30 09:49:30  

2023年10月，哈尔滨医科大学附属第一医院孙备教授团队，李冠群、李乐等人在Nature子刊《Nature Communications》杂志在线发表题为“Gut microbiota aggravates neutrophil extracellular traps-induced pancreatic injury in hypertriglyceridemic pancreatitis”的研究论文。该研究对6只小鼠胰腺组织(3只FMT_hc、3只FMT_HTGP)进行了单细胞转录组学分析。该研究发现高甘油三酯血症性胰腺炎(HTGP)患者肠道单形拟杆菌(B.uniformis)丰度下调，导致其代谢产物牛磺酸水平降低，进而通过激活NF-κB、IL-17信号通路及促进结肠IL-17释放加速胰腺中性粒细胞胞外捕获网形成(NETs)，最终加剧HTGP胰腺损伤。本研究为肠道菌群恢复免疫动态平衡、缓解HTGP胰腺损伤提供有力证据。

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研究背景

高甘油三酯血症性胰腺炎(HTGP)发病率呈逐年升高趋势，呈现“年轻化、重症化、易复发、并发症多”等趋势，给临床救治工作带来极大困难。先前研究揭示HTGP过程中出现肠道菌群紊乱、免疫稳态失衡、代谢途径破坏等多种病理学变化。肠道菌群作为机体的重要组分，参与调控代谢产物合成、宿主防御及免疫调节等多种生物学过程。然而，肠道菌群是否调节HTGP进展缺乏充足的实验证据，及其具体分子机制尚不清晰。

方法流程

1.16s rRNA：25名HTGP患者、16名健康志愿者(HC)和8名高甘油三酯(HTG)对照者肠道内容物；

2.16s rRNA：8只FMT-HTGP、8只HTG FMT-HTG和6只FMT-HC小鼠肠道内容物；

3.scRNA-seq：3只FMT-HTGP和3只FMT-HC小鼠胰腺组织；

4.代谢组：6只FMT-HC和8只FMT-HTGP小鼠血清；3只HTGP组和B.U+ HTGP组小鼠粪便；6只FMT-HC和6只B.U+ HTGP组小鼠血清。

研究结果

1.HTGP患者肠道菌群的变化

为了探讨肠道微生物群对HTGP患者胰腺损伤的影响，作者比较了25名HTGP患者、16名健康志愿者(HC)和8名高甘油三酯(HTG)对照者的临床特征和肠道微生物群组成(图1a)；使用16s核糖体RNA (16s rRNA)测序进一步分析了肠道微生物群组成。辛普森指数描述HTGP患者与健康志愿者相比α多样性降低(图1b)；非度量多维尺度(NMDS)分析显示两组微生物组成明显分离(图1c)。HTGP患者在微生物的科和属水平上显示差异(图1d)；HTGP患者中存在差异细菌种类(图1e)。HTGP患者中克雷伯菌、肠球菌和志贺氏埃希菌的丰度较高，而有益菌丰度较低(图1f)。全身性炎症反应综合征(SIRS)患病率和ICU入院率与Faecalibacterium、Bacteroides uniformis和Collinsella aerofaciens丰度呈负相关。较高的血清c反应蛋白(CRP)水平与多粒下带和双歧杆菌的丰度呈正相关(图1g)。这表明特定的细菌种类与疾病的严重程度相关，并决定患者的预后。

图1 HTGP患者肠道菌群的变化

2.肠道菌群失调加剧了HTGP的进展

利用HTGP患者(FMT-HTGP)、HTG对照(FMT-HTG)和健康志愿者(FMT-HC)的肠道微生物群定殖到小鼠肠道建立粪菌移植(FMT)小鼠模型；与FMT-HC和FMT-HTG组相比，FMT-HTGP加重了胰腺损伤和全身炎症，胰腺组织学评分、血清淀粉酶、脂肪酶和IL-1β水平升高(图2b,c)。此外，与从其他类型AP患者获得的肠道微生物群定殖的小鼠(FMT-AP)相比，FMT-HTGP小鼠表现出更严重的胰腺损伤(补充图)，这表明肠道微生物群中HTGP相关的变化是加剧胰腺损伤的关键因素，HTGP独特的肠道微生物特性可能决定了与其他类型AP相比的不同结果。肠道微生物群的改变对HTGP的胰腺损伤和全身炎症反应起因果作用(图2d-g)。

图2 肠道菌群失调加剧了HTGP的进展

3.肠道微生物群通过减少中性粒细胞胞外陷阱来抑制HTGP的进展

在FMT小鼠模型中进一步探讨了肠道微生物群的免疫调节作用，与FMT-HC小鼠相比，FMT-HTGP小鼠胰腺组织中促炎中性粒细胞和巨噬细胞的比例增加(图3a)；基因富集分析表明，与FMT-HC小鼠相比，FMT-HTGP小鼠的白细胞活化、中性粒细胞浸润和中性粒细胞脱颗粒等炎症反应增加(图3b)。免疫组化染色证实FMT-HTGP增加了中性粒细胞浸润(图3c)。GSEA显示FMT-HTGP小鼠细胞外中性粒细胞陷阱形成上调，这被认为是一个确定的促炎生物学过程(图3d)。

为了进一步评估不同肠道菌群驱动HTGP的异质性，对胰腺组织中进行了scRNA-seq(图3e)。与FMT-HC组相比，FMT-HTGP组中性粒细胞比例增加(图3f)，并且FMT-HTGP小鼠的中性粒细胞胞外陷阱通路的形成被激活(图3g,h)；与通路分析一致，FMT-HTGP增加了胰腺中作为NETs形成关键调节因子的Padi4、Nfκb和Il17a的表达(图3i)；发现FMT-HC小鼠中CitH3和Mpo共定位明显减少，这表明“健康”的肠道微生物群抑制了NETs的形成(图3k)。我们还发现，FMT-HTGP小鼠血清中CitH3和dsDNA水平升高(图3i)表明HTGP源性肠道微生物群通过影响NETs的形成加重了胰腺损伤。

图3 牛磺酸通过抑制NETs减轻HTGP

4.Bacteroides uniformis通过抑制中性粒细胞浸润和减少NETs来缓解HTGP

为了确定哪些细菌种类影响HTGP中NETs的形成，作者比较了HTGP患者和小鼠模型之间的肠道微生物群组成。从众多候选菌中挑选发挥作用的有益菌，发现HTGP患者和受体小鼠中Bacteroides uniformis的丰度均较低(图4a)。作者建立HTGP小鼠模型(图4b)观察到，单形拟杆菌通过减少中性粒细胞浸润和NETs来抑制胰腺损伤(图4c-e)。给药单形拟杆菌可减轻GPIHBP1^−/−小鼠的胰腺损伤(图4f-h)。分别增加拟杆菌/Ly6G的中和均改善胰腺损伤，但在耗竭掉中性粒细胞的情况下，增加拟杆菌并不能是胰腺损伤得到改善，这表明单形拟杆菌通过嗜中性粒细胞依赖的方式减轻胰腺损伤。因此，单形拟杆菌减少了炎症胰腺中抑制NETs网状结构的形成(图4i-k)。研究结果表明，单形拟杆菌通过限制中性粒细胞浸润和减少NETs来改善HTGP。

图4 单形拟杆菌通过抑制中性粒细胞和减少NETs来缓解HTGP

5.牛磺酸通过抑制中性粒细胞浸润和减少NETs来缓解HTGP

肠道微生物衍生的代谢物被认为是炎症性疾病的中枢调节因子。作者分析FMT小鼠模型的血清代谢物，发现FMT-HC和FMT-HTGP小鼠之间有29种代谢物差异(图5a)；单形拟杆菌相关的牛磺酸产生可能减轻胰腺损伤(图5d,e)。进一步发现在诱导型HTGP模型中，牛磺酸通过抑制中性粒细胞浸润和减少NETs来降低血清促炎细胞因子和改善胰腺损伤(图5g-j)。随后发现口服补充牛磺酸可提高其在胰腺和循环中的水平，从而减少NETs的形成，减轻胰腺损伤和全身炎症(图5k-n)。总之，无论高甘油三酯血症的因素如何，单形拟杆菌产生的牛磺酸都能抑制HTGP的发展。

图5 单形拟杆菌衍生的牛磺酸可改善HTGP

6.牛磺酸通过抑制NETs减轻HTGP

肽基精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)在驱动NETs形成的中性粒细胞中特别表达。因此建立PAD4^-/-小鼠模型，探究牛磺酸通过抑制NETs形成减轻HTGP的假设(图6a)；PAD4^-/-小鼠表现出轻度胰腺损伤和较少的中性粒细胞浸润，补充牛磺酸未能减轻HTGP(图6b-e)。牛磺酸处理或不处理的PAD4^-/-小鼠中Mpo/CitH3双染色阳性和Sytox Green阳性区域的减少，表明牛磺酸通过NETs特异性机制减轻HTGP(图6f,g,i)。为了确定牛磺酸是否通过体外抑制NETs减轻胰腺损伤，分离的中性粒细胞使用PMA(NETs诱导剂)处理中性粒细胞。在PMA刺激下牛磺酸降低了NETs，并降低了无细胞上清中的DNA水平(图6h)。这些揭示了通过补充牛磺酸靶向抑制NETs形成，限制了HTGP的发展。

图6 牛磺酸通过抑制NETs减轻HTGP

7.在HTGP患者中，牛磺酸抑制NETs并抑制炎症反应

为了解单形拟杆菌产生的牛磺酸与患者HTGP严重程度之间的联系，作者绘制单形拟杆菌丰度与血清牛磺酸水平之间的关系，并探讨了NETs形成与疾病严重程度之间的相关性(图7a)；结果显示，严重HTGP患者表现出NETs增加和血清中牛磺酸水平降低(图7b)。同时，牛磺酸水平与单形拟杆菌的丰度呈正相关，与NETs标志物呈负相关(图7c,d)。为了分析牛磺酸是否能在体外抑制NETs，从HTGP患者和健康志愿者中分离中性粒细胞，并检测NETs水平。与健康志愿者相比，HTGP患者的NETs水平升高，牛磺酸明显限制了NETs的释放(图7e)。将小鼠分离的中性粒细胞与来自不同类型供者的血清孵育，发现HTGP患者获得的血清与健康志愿者相比，具有更高的诱导NETs释放的能力(图7f)。这些结果强调了在临床中，B. uniform产生的牛磺酸与NETs形成之间的负相关。从健康个体的外周血中分离中性粒细胞，并用PMA处理以诱导NETs，结果表明，牛磺酸降低了NF-κB和Il17a基因表达(图7h,i)，以及NF-κB蛋白水平及其磷酸化(图7g)。这些结果表明，B. uniform衍生的牛磺酸限制了中性粒细胞中IL-17和NF-κB信号通路的激活，这些信号通路抑制了HTGP中NETs和胰腺损伤。

图7 在HTGP患者中，牛磺酸阻断NETs并抑制炎症反应

结论

本研究以“微生物-代谢-免疫”为研究主线，首先以16S测序分析HTGP患者肠道菌群变化，构建基因敲除(GPIHBP1^-/-)HTGP小鼠模型，模拟人体HTGP进展。随后利用粪菌移植实验，证实移植HTGP患者粪便显著加重疾病严重程度，并发现特异性菌群改变(B. uniformis)与HTGP进展密切相关。另借助scRNA-seq技术，确定在HTGP患者进展的过程中中性粒细胞起到关键的作用，发现单形拟杆菌作用下产生的牛磺酸可能通过抑制中性粒细胞活化及胰腺NETs形成，延缓HTGP进展。最后，利用单细胞测序、流式细胞术等发现肠道菌群衍生的牛磺酸可迁移至胰腺直接抑制NF-κB、IL-17信号通路激活减少胰腺NETs形成，另一方面肠道菌群可减少“肠-胰轴”Th17及IL-17的释放，抑制胰腺NETs形成并最终延缓HTGP进展。这一过程肠道菌群是必须依赖于中性粒细胞才可发挥作用。

参考文献

Guanqun Li, Liwei Liu, Tianqi Lu, et al. Gut microbiota aggravates neutrophil extracellular traps-induced pancreatic injury in hypertriglyceridemic pancreatitis. Nat Commun. 2023 Oct 4;14(1):6179. doi: 10.1038/s41467-023-41950-y.