项目文章 | 肿瘤相关成纤维细胞诱导复发性膀胱癌肿瘤微环境重塑
发布时间：2023-10-30 10:19:06
2023年9月，深圳大学吴松教授团队在国际著名杂志Advanced Science发表了题为“Cancer-Associated Fibroblast-Induced Remodeling of Tumor Microenvironment in Recurrent Bladder Cancer”的研究成果。该研究使用62,460个细胞的单细胞转录组数据，研究了原发和复发膀胱癌(BC)中肿瘤微环境(TME)的异质性。在复发性BC中发现了2种肿瘤干细胞亚型(CSC)、1种炎症性CAF亚型(ICAM1+iCAFs)与BC的复发有关。研究发现iCAFs分泌FGF2作用于rCSC-M的CD44受体，从而维持肿瘤的干性和上皮-间充质的转变。同时，复发性BC中富含THBS1+单核细胞，它是一组髓系来源的抑制细胞(MDSCs)，并与CAF相互作用。ICAM1+iCAF分泌CCL2与MDSCs中的CCR2结合。此外，iCAF中STAT3、NFKB2、VEGFA和CTGF水平的升高重塑了复发肿瘤的TME。在原位BC小鼠模型中抑制CCL2，抑制肿瘤生长、减少MDSCs和Tregs，并促进肿瘤免疫抑制。研究结果强调了iCAF在复发BC期间TME中细胞-细胞串扰的作用。探究发现BC复发的关键信号因素，为开发新的治疗方法提供潜在的指导意义。
新格元在该研究中承担了GEXSCOPE®单细胞转录组测序实验相关的工作。
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研究背景
膀胱癌是最常见的泌尿系统恶性肿瘤，是世界上第九大常见的癌症类型。肌层浸润性膀胱癌约25%，预后不良，严重影响患者的生活质量。非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)占其余病例的75%，复发率高，从50%到70%不等。NMIBC的治疗通常涉及多次手术切除和定期膀胱镜检查，导致治疗费用较高。然而，由于膀胱肿瘤的高度异质性，传统治疗方法疗效有限，导致临床疗效不佳。此外，膀胱癌的恶性程度、复发潜能、化疗耐受性与肿瘤微环境(TME)密切相关。因此，了解TME中不同成分的特征对于揭示膀胱癌复发的机制和开发新的治疗策略至关重要。
方法流程
本研究采取3个原发肿瘤，4个复发肿瘤以及1个正常的癌旁进行scRNA-seq，以此建立膀胱癌复发图谱，共收集到62,460个高质量细胞的数据，进一步分析发现一群与复发相关的CAF，该CAF群细胞与其他细胞群进行细胞交流，包括癌症干细胞(CSCs)和髓系来源的抑制细胞(MDSCs)，从而形成了有助于BC复发的免疫抑制微环境。这些发现为研究不同CAF亚群介导的TME内复杂的细胞相互作用提供了新的视角，并提供了潜在的治疗方法，扰乱CAF介导的TME调节以改善患者预后。
研究结果
1.复发性膀胱癌的单细胞转录组图谱
通过对scRNA-seq数据进行聚类分群及使用已知marker基因进行注释，共鉴定出5种主要的细胞类型：51,439个上皮细胞、5,070个髓系细胞、3,241个成纤维细胞、2,564个内皮细胞和1,926 T细胞。为了显示原发和复发BC的TME内不同的亚细胞相互作用，使用CellCall工具进行细胞通讯分析结果显示，与复发性BC相比，原发BC的细胞间串扰事件显著增加。原发的BC中上皮细胞和T细胞之间的交流有限，而在复发的BC中成纤维细胞和髓细胞之间的相互作用信号变得更强，表明在复发的肿瘤中可能存在免疫逃逸的机制。
图1 膀胱癌组织的各类细胞类型的转录组图谱
2.CSC亚群的异质性特征
由于膀胱癌肿瘤细胞来源于尿路上皮细胞，因此针对上皮细胞特征进行详细解析，上皮细胞亚群细分获得17个亚群，根据CSCs标记物CD44, ALDH1A1, SOX4表达，鉴定了原发肿瘤中cluster 2以及复发肿瘤中cluster 3、5、16为CSC亚群，利用Monocle2对CSCs从原发到复发的进化轨迹分析显示，CSCs有三个分支：两种类型的复发相关分支(rCSC-N在第3群和rCSC-M在第5和16群)，一个原发分支(pCSC-N在第2群)。rCSC-M表达的基因具有与pCSC-N相似的分化路径，而rCSCN具有不同的基因表达模式。另外观察到TIMP1(一种参与金属蛋白酶介导的细胞外基质(ECM)重塑的标志性基因)随着拟时间的发生表达显著增加，GSVA和AUcell的基因集评分分析显示，rCSC-M亚群(第5和16群)有显著的上皮-间充质转化(EMT)和耐药特征。Scenic分析还表明在原发和复发的CSCs亚群中发生了转录重编程，其中转录因子JunB和BHLHE40(与TME中的耐药和转移前表型有关)在rCSC-M亚群中更强的调控活性。这些发现表明rCSC-M亚型与BC复发密切相关。
图2 CSC亚群的转录特征分析
3.复发性BC患者CAF的特殊功能表型
基于BC队列中与复发相关的基因组(GSE13507)信息，将重点放在成纤维细胞上，成纤维细胞亚群细分得出4种亚型：ICAM1-iCAF、ICAM1+iCAF、RGS5+mCAF、增殖成纤维细胞，通过免疫荧光(IF)染色对原发和复发肿瘤的CAF亚群进行了验证。拟时间轨迹分析发现ICAM1+iCAF可能来自ICAM1-iCAF，ICAM1+iCAF显示出与炎症反应相关的基因(如TNFAIP6和Ptgs2)的高表达，与肿瘤转移和耐药相关的基因AREG的高表达。irGSEA分析表明iCAF与EMT和血管生成有关，ICAM1+iCAF在炎症反应、通过NF-κB途径的TNFA信号转导及对干扰素-γ反应中显示出高活性。此外，ICAM1+iCAF丰度较高与较差的无病生存率(DFS)相关。SCENIC分析显示NFKB2、STAT3、TCF21、TWIST2等转录因子在ICAM1+iCAF中高度激活。前期研究表明，STAT3和NFKB2是MDSCs免疫抑制激活的驱动因素，TCF21和TWIST2与EMT有关。这些发现表明ICAM1+iCAF在BC的复发中起关键作用。
图3 成纤维细胞转录特征分析
4.复发性膀胱癌患者中富含CAF和CSCs之间的通讯
Cellchat和Cellhonedb分析结果表明，ICAM1+iCAF通过趋化因子信号通路(CCL2-ACKR1和CXCL12-CXCR4轴)招募rCSC-M，并在复发肿瘤的共刺激通路中通过受体FGF2与rCSC-M的配体CD44结合,同时FGF2在ICAM1+CAF中的高表达，与预后不良显著相关。通过IF染色证实了FGF2+细胞和CD44+细胞的接近及FGF2在复发肿瘤中的高表达。前期研究，转录因子JunB直接与CD44启动子序列结合调节造血祖细胞的分化。本研究rCSC-M亚群中发现JunB基序高度激活，TCGA BLCA队列的Spearman相关性表明JunB和CD44的表达呈正相关。进一步的细胞功能实验(Transwell和球形形成实验)结合siRNA验证了JunB基因敲除细胞系中干性和EMT相关基因的表达，发现JunB促进了肿瘤细胞的干性和迁移。表明，JunB调节FGF2-CD44信号通路，该调节可能在复发肿瘤中保持干性并促进rCSC-M的EMT。
图4 成纤维细胞和CSC亚群的细胞通讯及关键基因潜在作用的功能验证
5.复发性BC中髓系细胞亚群的初始肿瘤表型特征
髓系细胞GO功能富集分析显示，DEGs主要与粒细胞趋化、体液免疫反应和髓系白细胞迁移有关，表明它们可能参与调节TME中的免疫细胞渗透。髓系细胞细分得出3个亚群：MRC1+SPP1-巨噬细胞，MRC1+SPP1+巨噬细胞，THBS1+单核细胞，且通过IF染色进行了验证。使用BC队列证实了THBS1+单核细胞在复发样本中的高占比及其与不良DFS预后的显著相关性，GSVA和AUCcell分析显示，THBS1+单核细胞表现出TNFA-Via-NF-KB信号通路的丰富、炎症反应、血管生成和低氧诱导。另外髓系细胞亚群也表达高水平的基因TGFB1、S100A8和S100A9，这些基因被报道有利于MDSCs介导的转移前微环境的形成。髓系细胞的拟时间轨迹分析显示，THBS1+单核细胞亚群的拟时间得分最低，表明处于初始阶段。因此，THBS1+单核细胞可能是参与肿瘤免疫抑制的MDSCs。
图5 髓系细胞转录特征分析
6.复发性膀胱癌患者中富含CAF和髓系亚群之间的通讯
为研究各种细胞因子的表达水平，ICAM 1+iCAF中的CCL2、IL-6、TGFB、CTGF等显著表达，免疫组织化学(IHC)染色显示2个ECM重塑相关基因CTGF和TGFB1在复发性BC中显著上调。进一步研究CAF和髓系细胞亚群间相互作用，使用CellCall分析发现ICAM1+CAF和THBS1+单核细胞的相互作用在贴壁连接和趋化因子信号通路高表达，同时发现ICAM1+iCAF与THBS1+单核细胞相互作用通过CCL2/CCL11受体和CCR2配体，RGS5+mCAF通过CCL2-CCR2轴与THBS1+单核细胞相互作用，THBS1+单核细胞通过JAG1-NOTCH3轴与RGS5+mCAF相互作用。JAG1介导Notch信号通路促进CSCs的EMT和血管生成，复发肿瘤CAF和髓系亚群显示高水平的信号分子，如CCL2，CCL11，CCR2，JAG1， NOTCH3。IF染色还显示复发肿瘤中高丰度CCL2和CCR2+细胞。综上，提示ICAM1+iCAF可能通过CCL2-CCR2信号轴招募MDSCs(THBS1+单核细胞)来介导复发癌症的免疫抑制。
图6 成纤维细胞亚群与髓系细胞亚型的细胞通讯信息
7.阻断CCL2对复发性BC肿瘤形成及免疫抑制特性的影响
为验证CCL2的致癌作用，利用CCL2的抑制剂吡非尼酮(PFD)治疗MB49细胞-C57BL/6J小鼠膀胱原位肿瘤模型，结果表明PFD治疗的小鼠显示出更低的肿瘤负担，肿瘤体积和重量更低。流式细胞术分析显示，治疗组肿瘤内MDSCs和Tregs的丰度降低，CD4+T细胞的丰度增加；因此探究复发肿瘤中T细胞的变化，将scRNA-seq中T细胞分为5个亚群，复发肿瘤中Tregs的丰度显著增加，CD4+T细胞的比例降低，与流式细胞术分析相一致。同时CXCL13+CD4+T细胞是免疫检查点阻断的肿瘤抗原特异性T细胞，其丰度在原发肿瘤中显著较高；还检测了免疫检查点受体在各个T细胞亚群中的表达，发现CD96和KLRB1(CD161)的表达在CD8+T细胞中的表达较高。CD161阻滞剂已被报道能有效地增强T细胞介导的对胶质瘤细胞的杀伤作用，并显著改善抗肿瘤功能。另外，CXCL13+CD4+T细胞群对淋巴细胞活化和细胞对干扰素的反应具有正向调节作用，复发肿瘤中的T细胞亚群与免疫反应的负调节和涉及免疫反应的中性粒细胞激活有关；特征基因集评分显示复发肿瘤中T细胞增强了与TME内的促炎反应和低氧诱导相关的通路的活性，进一步表明复发BC表现出TME更高的免疫抑制特征。
图7 CCL2与复发性BC的肿瘤发生和免疫抑制特性有关
结论
本研究针对原发和复发的膀胱癌进行了scRNA-seq分析，揭示了复发的膀胱癌的TME内的异质性。通过构建细胞相互作用网络、体外细胞实验、小鼠肿瘤模型和公共肿瘤数据库的挖掘，揭示了导致肿瘤复发的关键CAF亚群和分子背后的分子机制。目前针对肿瘤相关成纤维细胞(CAF)的各种治疗方法被记录在案，包括使用特异性抗体和抗体与光敏剂的偶联。BC对内窥镜治疗方法具有很高的亲和力，原位靶向CAF可能在抑制肿瘤复发方面产生更有效的结果。这些发现阐明了复发BC的调控机制，并为开发新的治疗策略提供了信息。
图8 以ICAF亚型为中心的复发性BC TME的预测调控网络图
参考文献
Liang T, Tao T, Wu K, et al. Cancer‐Associated Fibroblast‐Induced Remodeling of Tumor Microenvironment in Recurrent Bladder Cancer[J]. Advanced Science, 2023: 2303230.
