项目文章 | 单细胞核转录组测序解锁包涵体肌炎中新型纤维-脂肪祖细胞
发布时间：2023-11-02 10:09:31
2023年9月，德国杜塞尔多夫海因里希·海涅大学(Heinrich Heine University)神经内科研究团队在《ACTA NEUROPATHOLOGICA》杂志上发表了题为“Senescent fibro-adipogenic progenitors are potential drivers of pathology in inclusion body myositis”的文章。该研究通过对包涵体肌炎(IBM)股四头肌的肌肉样本进行了单细胞核转录组测序(snRNA-seq)，确定了一组特定的纤维-脂肪祖细胞(FAPs)，这些祖细胞显示出衰老的关键特征，包括促炎表型、p21表达、β-半乳糖苷酶活性增加和其他衰老途径的参与。为改善IBM肌肉表型提供一种治疗的创新策略。
新格元在该研究中承担了单细胞核转录组(GEXSCOPE®)测序实验相关的工作。
下面和元小新一起来看看吧~
研究背景
包涵体肌炎(IBM)因其独特的临床表现和难治性在特发性炎症性肌病(IIM)谱中是独一无二的。对这种耐药性的一种解释可能是细胞自主参与的机制，这些机制维持或促进IBM的疾病进展，而与炎症活动无关。在这项研究中，作者专注于组织驻留细胞的衰老作为疾病的潜在驱动因素。
思维导图
研究结果
1.p21衰老细胞在IBM的肌肉中含量丰富
最近在小鼠和人体组织中的几项研究表明，p21调控骨骼肌的衰老程序，并作为肌肉细胞衰老的标志物。通过免疫荧光，发现与非疾病对照(NDC)和免疫介导的坏死性肌病(IMNM)患者相比，IBM的p21细胞数量更多。为了进一步证实这一数据，作者还通过PCR在基因水平上分析了p21，观察到与NDC或IMNM患者相比，IBM中CDKN1A(编码p21)的表达增加。值得注意的是，长期疾病状态与p21细胞数量的增加有关。按照这一论证思路，作者旨在研究单细胞(细胞核)水平上IBM肌肉中肌源性和非肌源性细胞的衰老。
图1 P21+衰老细胞在IBM肌肉中富集
2.单核转录组测序鉴定肌肉细胞类型及特征
为此，作者对三名IBM患者和三名NDC股四头肌的肌肉样本进行了snRNA-seq。质控后有~30,000个细胞核(其中~13,000个来自IBM肌肉和~17,000个来自NDC)用于下游分析，最终获得基于差异表达的九种主要细胞类型或亚型。为了了解衰老在致肌和非肌源性细胞中的分布，作者分析了CDKN1A的表达。与NDC相比，IBM中FAP和单核细胞/巨噬细胞表达CDKN1A的频率显著增加。然而，单个基因的表达不能很好地反映组织中细胞衰老的异质性。因此，作者确定了IBM和NDC所有细胞簇的差异表达基因(DEG)并利用SenMayo基因集(由125个与衰老信号通路相关的关键基因组成)进行富集分析，发现与NDC相比，只有IBM中的FAPs细胞簇在SenMayo中富集。
图2 IBM和NDC肌肉的单核RNA测序
3.单核转录组测序鉴定出驻留在IBM肌肉中的新衰老FAP群体
接下来，作者将研究重点放在FAP群体并进行深入分析。FAP是特化非肌源性细胞的谱系前体，包括活化的成纤维细胞、脂肪细胞和成骨细胞。对FAP进一步进行亚群细分，共获得4个亚群。其中，有前人研究报道的具有RYR1和TRDN表达的特征的与衰老相关的FAP亚型，还确定了两群仅在IBM患者中发现的亚群，第一个簇由Lumican(LUM)和原纤维蛋白-1(FBN1)的表达定义【LUMFBN1 FAPs已有报道，被认为是类似于与骨骼肌脂肪流入浸润相关的表达代谢酶(MME)的FAPs】，并且极大程度上特异性表达衰老标志物CDKN1A，因此，作者将这些FAP称为CDKN1A，以强调它们的衰老表型以及与p21途径的关联。最后一种的身份特征在于XIAP相关因子1(XAF1)和动力蛋白-1(DNM1)的表达。这些标志物先前在FAP中已有描述，但目前尚不清楚其作用。
进一步分析CDKN1A+FAP亚群，发现它展现出细胞衰老的关键特征，包括衰老标志物的表达，促炎分泌表型和促纤维化表面分子的参与，衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)的激活和其他与衰老相关的转录组学特征。
图3 一种新的衰老FAP群体存在于IBM肌肉中
4.IBM表现出2A型肌纤维的明显丧失
接下来，作者分析了IBM的肌核区室，并将其与NDC进行了比较，与NDC相比，单核细胞/巨噬细胞以及T，B和NK细胞在IBM中扩增。此外还观察到，与NDC相比，IBM中2A型和2X型肌纤维数量显著减少。进一步对肌源性细胞进行亚群细分，共获得5个亚群，与NDC或IMNM患者相比，IBM的2A型肌纤维显著减少而1型肌纤维的相对频率更高。因此，2A型肌纤维的选择性缺失似乎是IBM病理形态的特征。
图4 IBM表现出2A型肌纤维的明显损失
5.骨骼肌细胞在IBM中假设炎症重编程
接下来，作者专注于炎性肌核的亚群。这些细胞仅在IBM中表现出C3或HLA-A等基因的高表达，而在NDC中则不然。对细胞内C3进行了IF染色(因为该基因的表达仅在IBM患者的炎性肌核中检测到，但在NDC或IBM的其他肌核亚群中未检测到，这表明有足够的特异性作为标志物)，发现与NDC或IMNM肌肉相比，IBM细胞中C3染色的肌纤维丰富。为了进一步表征这些肌纤维的表型，作者比较IBM和NDC之间炎症性肌细胞的DEG。基因富集分析显示出促炎途径参与，包括免疫球蛋白介导的免疫反应，适应性免疫反应，先天免疫反应。特别发现是B细胞介导的免疫反应。
图5 骨骼肌细胞在IBM中进行炎性过程的重编程
6.IBM肌纤维失去了终板形成的潜力
为了进一步表征IBM中肌源性隔室的变化，作者旨在验证表达AChR(CHRNA1)的肌纤维的减少。分析发现，IBM的肌源性隔室的特征是构成NMJ(神经—肌肉接头，是形成神经-肌肉通讯所必需的)的肌核和2A型肌核的缺失，导致IBM肌肉的终板形成受损，可能影响神经- 肌肉通讯。相反，C3的表达确定了IBM肌肉中存在的一个独特的促炎的细胞核亚群。
图6 IBM肌纤维失去了终板形成的潜力
7.FAP显示胶原稳态的改变，对IBM的肌肉健康有潜在影响
最后，作者旨在确定FAP的衰老是否可能与肌源性隔室的变化有关。FAP及其成纤维细胞谱系是骨骼肌稳态所需的细胞外基质蛋白的主要来源。对CDKN1A FAP中top失调基因的筛选揭示了胶原蛋白表达的变化，特别是COL15A1(编码XV型胶原的亚型)，以及编码I型胶原的COL1A1和COL1A2。然而，对FAP子簇的进一步分析表明，CDKN1A FAPs在IBM和NDC之间胶原表达发生了变化，显示出COL15A1急剧下调，但富集 COL1A1以及COL1A2表达。这两种类型的胶原蛋白都是稳定骨骼肌细胞及其分化的必要物质。为了更好地了解FAP和肌纤维之间的通讯，作者通过CellChat分析了转录组数据中的细胞间通讯，猜测细胞外基质组成的转变可能对IBM的肌纤维健康产生功能影响。通过流式分析，发现衰老的FAP表现出改变的胶原蛋白稳态向I型胶原转变。
图7 FAP表现出胶原稳态的转移，对IBM的肌肉健康有潜在影响
结论
本研究强调了功能失调的组织驻留细胞对IBM病理生理学的影响，IBM的治疗策略可能倾向于探索一种针对入侵免疫细胞的综合方法。
参考文献
Nelke C, Schroeter CB, Theissen L,et al. Senescent fibro-adipogenic progenitors are potential drivers of pathology in inclusion body myositis. Acta Neuropathol. 2023 Nov;146(5):725-745. doi: 10.1007/s00401-023-02637-2. Epub 2023 Sep 29. PMID: 37773216; PMCID: PMC10564677.
