项目文章 | 看单细胞技术如何解析非节段性白癜风的外周免疫反应
发布时间：2024-01-15 10:16:38
2023年11月，西安交通大学第一附属医院皮肤科牟宽厚课题组发表“Single-cell transcriptomics reveals peripheral immune responses in non-segmental vitiligo”的研究成果。本文对正常对照组(HC)和白癜风患者(PV)的PBMC样本进行单细胞转录组测序(scRNA-seq)研究白癜风患者外周免疫应答的机制，该研究揭示了白癜风患者外周血免疫细胞的遗传和信号通路特征，为其发病机制提供了新的见解，这可能有助于确定潜在的治疗靶点。
新格元在该研究中承担了单细胞转录组(GEXSCOPE®)测序以及生信分析等工作。文章利用新格元自主研发的Singleron Matrix®自动化单细胞文库构建系统完成文库构建，CeleScope®生信分析软件进行质控并生成表达矩阵，并通过SynEcoSys®单细胞数据库完成精准的细胞注释和专业的生物信息挖掘。
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研究背景
白癜风是一种常见的自身免疫性色素脱色皮肤病，是由于黑素细胞的破坏。大量证据表明白癜风与全身免疫激活有关。以往的研究主要集中于免疫细胞在病变区域内和周围的浸润，但很少对外周血循环免疫细胞的细胞类型和功能进行研究。
方法流程
作者收集5名PV患者和3名健康对照(HCs)PBMC样本进行单细胞转录组测序(scRNA-seq)，总共获得127,804个高质量细胞数据(PV组71,966个细胞，HCs组55,838个细胞)，对关注的细胞进一步分析(差异表达、互作分析等)，并采用流式细胞术和qPCR进行结果验证。
研究结果
1.PV患者循环免疫细胞的单细胞图谱
从5名PV患者(PV组)和3名健康对照(HC组)中分别收集PBMC样本进行单细胞转录组测序(scRNA-seq)。根据典型标记基因的表达共鉴定出10种主要的细胞类型，包括NK细胞和T细胞、单核细胞、B细胞、浆细胞、经典树突状细胞，浆细胞样树突状细胞、血小板、嗜碱性粒细胞、红细胞和中性粒细胞。所有细胞类型组间占比没有显著差异。
图1：PV患者循环免疫细胞的单细胞景观
2.PV患者T细胞和NK细胞的特征
T细胞和NK细胞是外周血单核细胞中数量最多的免疫细胞。使用经典标记基因将T细胞和NK细胞细分为9个细胞亚型：NK细胞(NK)、幼稚CD4+ T细胞(CD4NaiveT)、幼稚CD8+ T细胞(CD8NaiveT)、效应CD8+ T细胞(CD8Teff)、CD8+粘膜相关常量T细胞(CD8MAIT)、γδT细胞(GDTcells)、NKT细胞、调节性T细胞(Tregs)和增殖T细胞(ProliferingTcells)。与HC组相比，PV组NK细胞占比增加，而Tregs占比却减少。
基于差异基因功能富集分析，作者发现Treg参与了对干扰素-γ的上调反应。之后采用流式细胞术和qPCR检测Tregs、Th1-like Tregs的组成及关键基因的表达。流式细胞术分析显示，与HC组相比，PV组Tregs丰度降低，但Th1-like Tregs的比例增加。由于FoxP3和CTLA4的表达对Tregs的免疫抑制功能至关重要，作者通过qPCR检测了FoxP3和CTLA-4基因表达情况，结果显示，与HC组相比，PV组中FoxP3基因表达明显降低，而CTLA-4基因表达降低不显著；NK细胞参与抗原加工和递呈，对干扰素-γ的上调反应和T细胞活化。NKT细胞参与了对干扰素-γ的上调反应、趋化性调节、抗原加工和提呈。结果表明，PV患者的T细胞和NK细胞，特别是NK细胞和NKT细胞，表现出一致的炎症反应，如对干扰素的反应上调。
图2：PV患者NK&T细胞的异质性
图3：PV患者NK&T细胞的转录特征
图4：流式细胞术和qPCR验证Tregs和Th1-like Tregs
随后，鉴于NK、Treg、NKT和Teff与白癜风有较强的关联，作者采用单细胞调节网络推断和聚类(SCENIC)对上述4种细胞类型中表现出异常激活的转录因子进行分析，分析发现：与HC组相比，PV组中NK细胞REL(抗炎因子IL-12和IL-10信号的重要调节因子)和RUNX3(抑制髓细胞分化的调节因子)以及几种未知调节因子(NR2C1、BHLHE40、ZNF250、HES6和FOXP4)表达下调，而NFIL3 (NK细胞分化的重要TF)和其他调节因子(NUAK1、HIVEP1、HHEX)表达上调。在PV组中Treg细胞FOXP3、IKZF2(Treg稳定性和功能相关调控因子)和其他调控因子(BCL3、ZNF579、ZNF80)显著下调；PV组中NKT细胞RORB、ING4、IKZF2、ZNF418表达下调，而ZFP2、NUAK1的表达上调。PV组中CD8Teff细胞ASCL2(抑制Th1、Th2和Th17细胞分化)表达下调，而HHEX表达上调。
接下来，作者对CD8+ T细胞进行拟时序轨迹分析。通过热图分析发现CD8+ T细胞从cluster2(高表达PABPC1、RPS20和RPL18)向cluster1和cluster4(高表达GZMH和NKG7)这两个簇进行分化。轨迹分析结果展示CD8NaiveT被认为是其他细胞的前体，轨迹是从CD8NaiveT向CD8MAIT和CD8Teff两个方向发育分化。
图5：CD8+ T细胞分化轨迹分析
3.PV患者B细胞的特征
将B细胞进行亚群细分鉴定出2种细胞亚型：幼稚B细胞(NaiveB)和记忆B细胞(MemoryB)。其中幼稚B细胞高水平表达TCL1A、IGHD和FCER2，而记忆B细胞高水平表达IGHG1、IGHG3和IGHG4。幼稚B细胞和记忆B细胞组间占比没有显著差异。
组间差异分析发现PV组记忆B细胞IGHA1、IGHA2和IGHG1基因(这些基因参与体液免疫)表达显著上调，且PV组记忆性B细胞显著富集参与B细胞活化通路，如免疫球蛋白复合物和B细胞受体信号通路，提示PV与适应性免疫有关。
图6：PV患者B细胞的异质性和转录特征
4.PV患者单核细胞和DCs的特征
将单核细胞进行亚群细分鉴定出2种细胞亚群：经典单核细胞(ClassicalMo，CD14高表达)和非经典单核细胞(Non-classicalMo，CD14低表达、FCGR3A高表达)。其中经典单核细胞高水平表达S100A8、S100A9、VCAN、S100A12和LYZ，而非经典单核细胞高水平表达SMIM25、RHOC、LYPD2、CDKN1C和FCGR3A。组间比较分析发现PV组中非经典单核细胞的炎症基因(TNF、IL1B、DUSP2和S100A8)、趋化因子(CCL3、CCL3L1、CCL4L2和CXCL8)和转录因子 (EGR1、FOS、JUN和JUND)表达明显上调。通过GO功能富集分析，发现PV组非经典单核细胞差异基因参与对干扰素-γ、抗原加工和呈递以及T细胞活化的反应。使用SCENIC分析亚群组间转录因子差异，分析发现经典单核细胞优先上调RUNX1、MXI1、HMGB2、CREB5、BATF、FOSL2、FOS和JUN转录因子，而非经典单核细胞上调NFE2L1、 TCF7L2、HES1、MAFB、CEBPB和ZBTB7A转录因子。
对DCs(cDCs和pDCs)进行组间差异，分析发现cDCs有31个显著上调基因和6个显著下调基因。GO分析发现PV组cDCs上调基因富集于抗原加工和呈递。此外，还发现pDCs有180个显著上调基因和174个显著下调基因。GO分析发现PV组pDCs上调基因富集于抗原加工和呈递、中性粒细胞脱粒和干扰素-γ介导的通路。
PV组的单核细胞和DCs均表现出对干扰素-γ和抗原加工和呈递的上调反应。这些结果表明，PV患者的先天免疫细胞，特别是非经典单核细胞和pDCs，表现出活跃的炎症状态。
图7：PV患者单核细胞的异质性和转录特征
5.PV患者中性粒细胞的特征
将中性粒细胞细分为三个亚群，分别是Neutrophils_1(高表达FCGR3B、CXCL8和SAT1)、Neutrophils_2(高表达DEFA3、CAMP和LTF)和Neutrophils_3(高表达CCR5、GNLY和TRBC2)，不同亚群组间细胞占比没有显著差异。组间差异分析发现PV组Neutrophils_3主要参与中性粒细胞活化、T细胞活化和免疫应答活化信号；对中性粒细胞进行炎症基因集打分分析，发现Neutrophils_1具有较高的炎症响应得分。
图8：PV患者中性粒细胞的异质性和转录特征
6.PV患者外周血循环免疫细胞的细胞相互作用
采用CellChat预测PV组和HC组外周血中各种免疫细胞群之间相互作用的数量和强度。分析发现PV组与HC组细胞间通讯分析是相似的，且在HC组中确定了31个重要的信号通路，在PV组预测了4个特有的信号通路，包括MIF、SELPLG、CSF和CXCL信号通路。
作者重点分析了PV组MIF和CXCL信号通路的变化。首先对于MIF通路，配体受体层次图显示大多数免疫细胞之间通过MIF途径存在密切关系。网络中心性评分可视化显示，来自T细胞和DCs的大多数向外信号由单核细胞接收，这表明细胞之间的大多数MIF相互作用是旁分泌的。几乎所有的细胞群都是MIF通路的影响者。在配体-受体对方面，MIF信号通路涉及3对配体-受体对，按照相对贡献从高到低依次为CD74-CXCR4、CD74-CD44和CD74-CXCR2。其次对于CXCL信号通路，配体受体层次图显示只有一种类型的靶细胞(中性粒细胞)，中性粒细胞和单核细胞是主要来源。此外，网络中心性评分可视化显示，中性粒细胞是CXCL信号通路中重要的影响细胞。中性粒细胞是自分泌和旁分泌途径中CXCL的主要信号来源。在配体-受体对方面，CXCL信号通路涉及6对配体-受体对，按照相对贡献从高到低依次为CXCL8-CXCR2、CXCL8-CXCR1、CXCL2-CXCR2、CXCL1-CXCR2、CXCL2-CXCR1和CXCL1-CXCR1。接下来，作者通过qPCR分析了CXCL8、CXCL9、CCL5和CXCR2在PV组和HC组PBMC样本中的mRNA表达差异，结果显示PV组中CXCL8和CXCR2表达显著升高，但CXCL9和CCL5表达升高不显著。
总的来说，相互作用分析强调了白癜风患者外周血循环免疫细胞通过MIF和CXCL信号通路促进免疫细胞过度激活的作用。
图9：HC组和PV组的不同通讯模式
图10：PV患者循环免疫细胞中复杂的细胞间通讯网络
结论
综上，通过scRNA-seq揭示了白癜风患者外周血免疫细胞的遗传和信号通路特征，作者发现PV患者的特征是具有促炎特性的调节性T细胞、NK细胞和DCs，以及活化的B细胞、单核细胞和中性粒细胞。这项研究结果为白癜风发病机制提供了新的见解，有助于寻找潜在的治疗靶点。
参考文献
Yang P, Luan M, Li W, Niu M, He Q, Zhao Y, Chen J, Mao B, Mou K and Li P (2023) Single-cell transcriptomics reveals peripheral immune responses in non-segmental vitiligo. Front. Immunol. 14:1221260. doi: 10.3389/fimmu.2023.1221260
