2024年1月，南京大学附属金陵医院肿瘤科褚晓源/雷增杰团队在1区TOP期刊《Cancer Letters》杂志在线发表了题为“scRNA-seq of colorectal cancer shows regional immune atlas with the function of CD20＋ B cells”的研究论文。该研究利用scRNA-seq等技术，描绘了结直肠癌不同区域的免疫微环境图谱，分析了其异质性并证实肿瘤浸润的CD20＋ B细胞的潜在作用，表明结直肠癌具有明显的区域异质性，肿瘤浸润的CD20＋ B细胞与结直肠癌预后相关，可能促进免疫检查点抑制剂PD-1抗体的疗效。
新格元在该研究中承担了单细胞转录组测序(GEXSCOPE®)、单细胞数据联合公共数据集分析等工作。
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研究背景
结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)是全球流行的恶性肿瘤之一，全球癌症统计2020结果显示结直肠癌的发病率位于第三位，死亡率仅次于肺癌位居第二。中国人的健康也承受着结直肠癌的威胁，其发病率和死亡率逐年增长。随着治疗方案的进步，结直肠癌的生存率略有提高，但是受益人群有限。因此，研究结直肠癌的肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)，尤其是免疫微环境，具有重要的意义。不同分区结直肠癌具有不同的特征，对传统放化疗、靶向治疗以及免疫治疗的疗效也存在差异。因此，探索不同分区之间结直肠癌的差异有一定的临床意义。
结直肠癌具有复杂的肿瘤微环境，对结直肠癌的进展和预后有重要的影响。传统的高通量测序为结直肠癌的肿瘤微环境研究带来了进展，但无法准确反映肿瘤细胞的异质性。单细胞测序技术帮助我们进一步在单个细胞水平上对结直肠癌进行研究。基于此技术，肿瘤免疫微环境得到更广泛的研究，一定程度上剖析了T细胞和B细胞的特征以及相互作用。近年来在多种肿瘤中发现B细胞以及三级淋巴结构与肿瘤的良好预后相关并且可以预测免疫治疗的疗效。然而，B细胞在对预测结直肠癌的预后这一观点尚有争议，其组成和作用有待进一步研究。
技术路线
研究结果
1.结直肠癌不同区域的不同免疫景观
该论文通过整合自测数据和GSE132465数据集，对来自CRC四个区域的19例样本的单细胞数据进行了联合分析，经过质控和去批次效应后，共获得39484个细胞进行下游分析，注释得到6种细胞类型，分别是myeloid、T/B cells、epithelial cells、fibroblasts、endothelial cells。进一步对各区域内(7个区域：ascending normal、ascending tumor、sigmoid normal、sigmoid tumor、rectum normal、rectum tumor、liver metastasis)肿瘤组织中免疫细胞内部各亚型的浸润情况分析，发现从近端到远端CRC中，B细胞呈减少趋势。
图1 结直肠癌不同区域的不同免疫景观
2.肿瘤组织中的浆细胞由正常组织中的IgA表型转变为IgG表型
首先，对B细胞进行亚群聚类，揭示了六个不同的簇，包含Memory B、Naive B、IgA Plasma、IgG Plasma、Proli Plasma和germinal center B cells (GCBs)。肿瘤样本中Naive B含量少于相邻的正常样本，而ST样本中没有Naive B。邻近的正常和肿瘤样本中，B细胞簇主要由浆细胞组成。此外，正常样本中的大部分浆细胞是IgA型浆细胞，而IgG型浆细胞的比例较小，肿瘤样本构成与之相反。
接着进行拟时序分析，B细胞在结直肠癌的不同区域表现出不同的分化和发育模式。根据目前对B细胞发育的理解，naive B在外界抗原刺激下分化为memory B 和plasma cells，设置naive B为起点。B细胞的轨迹被分为三个分支，每个分支对应一个不同的状态，称为S1, S2和S3，在S1和S3阶段观察到不同的发育轨迹。对S1和S3富集分析发现，S1富集到淋巴细胞和单核细胞的增殖、粘附和迁移有调节作用，而这些特征LM样本没有。相比之下，S3富集(不包括RCC样本)是特异性先天免疫功能的富集，包括通过吞噬和补体激活增强的B细胞活化。全面的B细胞分析揭示了它们在结直肠癌发生和发展过程中的功能。B细胞在结直肠癌的不同区域表现出不同的分化和发育模式。B细胞有可能与其他在结直肠癌中起关键作用的免疫细胞相互作用。
图2 B细胞亚群及其发育轨迹分析
3.B细胞与其他免疫细胞，特别是CD20+亚群有广泛的相互作用
在探索B细胞的发育过程中，发现它们在不同区域与其他免疫细胞密切相互作用。因此，利用CellPhoneDB来研究主要细胞簇内的细胞-细胞通信网络，并评估细胞成分的区域差异是否会影响细胞-细胞相互作用。在整个标本或AT、ST、RT和LM样品中，B细胞主要与髓系细胞相互作用，并且在肿瘤组织中的相互作用比在正常组织中更为明显。进一步推断了B细胞和髓系细胞在每个区域的特异性受体-配体(R-L)相互作用，以进一步研究这些相互作用如何影响肿瘤微环境。LAMP1_FAM3C、MERTK_GAS6、HLA-C_FAM3C和SPP1_CD44的相互作用在几种肿瘤中上调，与肿瘤的发展有关CD20+B和TNFRSF17+ B细胞与良好的总生存率相关。增强巨噬细胞迁移的SEMA4A_PLXND1在上升肿瘤样本中上调；HLA-DPB1_NRG1、CD52_SIGLEC10和LTBR_LTB在乙状结肠和直肠肿瘤样本中上调。CD52_SIGLEC10抑制免疫细胞的增殖和激活，这与乙状结肠和直肠样本中免疫浸润比上升样本低的情况一致。与侵袭、粘附和转移相关的受体配体对，如ANXA1_FPR1、LAIR1_LILRB4和FN1_a4b1复合物，在LM样品中显示出增加。尽管存在区域差异，但B细胞通过直接或间接的相互作用对肿瘤免疫微环境产生影响。
获得了B细胞与其他细胞簇比较的基因列表，鉴定出一组B细胞的特征基因，这有助于确定B细胞在肿瘤进展中的临床相关性和功能。随后，利用TCGA数据集进行预后分析，发现与肿瘤的发展有关CD20＋ B细胞与良好的总生存率相关。随后对来自TCGA的RCC、LCC和RC样本中的B细胞特征基因进行生存分析，进一步探讨不同地区样本中B细胞特征基因与预后的关系。具体而言，CD79B、CD20、TNFRSF17和SMIM14与RCC的良好预后相关。生存曲线显示CD20具有最显著的p值和长期生存获益。因此，聚焦于CD20＋ B细胞亚群。为了证实CD20＋ B细胞在肿瘤免疫微环境中的潜在调控作用，利用NicheNet分析发现CD20＋ B细胞倾向于招募和粘附其他淋巴细胞。综上，CD20＋ B细胞可能作为结直肠癌患者的预后指标，特别是RCC，并通过与其他免疫细胞的相互作用调节TME。
图3 B细胞与其他免疫细胞，特别是CD20亚群有广泛的相互作用
4、CD20＋ B细胞预测结直肠癌患者的预后
为了验证CD20＋ B细胞在结直肠癌中的预测预后作用，对另外209例患者进行了免疫组化染色。与上述TCGA结果一致，IHC染色结果一致显示CD20＋ B细胞与CRC患者生存率的提高呈正相关，特别是在RCC患者中。这种关联可能归因于三级淋巴结构的存在，同时细胞相互作用分析预测CD20＋ B细胞通过募集和粘附其他免疫淋巴细胞来调节TME，因此研究了CRC肿瘤内CD20＋ B细胞和CD3+ T细胞密度之间的关系。简单线性相关分析显示CD20＋ B细胞密度与CD3+ T细胞密度呈正相关。此外，观察到CD20＋ B细胞与CD3+ T细胞非常接近，并且经常形成小簇或三级淋巴样结构，这些结构可见于肿瘤床内和浸润边缘。考虑到CD20＋ B细胞和T细胞之间的相关性以及它们密切的空间关系，在探究它们各自的密度时，研究了它们对患者生存的影响。正如先前报道的那样，CD3+ T细胞的存在预测了CRC患者的生存。
图4 CD20＋ B细胞可预测结直肠癌患者的预后
5、体内外CD20＋ B细胞的缺失抑制肿瘤免疫杀伤
最后，通过同源小鼠皮下移植瘤模型和患者来源的类器官模型验证CD20＋ B细胞在肿瘤生长中起着重要作用，耗竭该细胞抑制了抗PD-1的肿瘤杀伤作用。
图5 在CRC小鼠模型中，抗CD20逆转PD-1抗体的抑制作用
图6 结直肠癌转移过程中的位置特异性抗肿瘤免疫
结论
该研究展示了来自不同区域的CRC的免疫特征，并且发现CD20＋ B细胞浸润与CRC患者的预后有关并可能促进抗PD-1的肿瘤杀伤作用，有望给结直肠癌的免疫治疗提供新的靶点。
参考文献
[1] Linlin Ji, Gongbo Fu, Mengxi Huang, et al.scRNA-seq of colorectal cancer shows regional immune atlas with the function of CD20＋ B cells.Cancer Lett. 2024 Jan 20:584:216664. doi: 10.1016/j.canlet.2024.216664. Online ahead of print.
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