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项目文章 | 单细胞整合常规转录组测序揭示HBV相关肝细胞癌CK19+肿瘤干细胞和其独特的SPP1+肿瘤相关巨噬细胞生态位

发布时间：2024-03-28 10:20:24

2024年2月，广西医科大学附属肿瘤医院的向邦德教授团队发表一篇题为“Integrating single‑cell and bulk RNA sequencing reveals CK19 + cancer stem cells and their specific SPP1 + tumor‑associated macrophage niche in HBV‑related hepatocellular carcinoma”的研究成果。本研究通过整合单细胞和Bulk RNA测序数据，来探索人类乙型肝炎病毒(HBV)相关的肝细胞癌(HCC)中CK19阳性的肿瘤干细胞(CK19+ CSCs)的异质性和干性特征，及其特异性富集的TAM_SPP1亚群的促肿瘤分子机制，为HCC提供新的潜在治疗靶点。

新格元在该研究中提供了GEXSCOPE^®单细胞转录组测序。

下面和元小新一起来看看吧~

研究背景

肝细胞癌(HCC)的高异质性是其治疗效果差的重要原因，CSC能够向多个方向分化为不同表型的癌细胞，是导致肿瘤异质性的最根本因素。在HCC中，CK19是CSC的标志物，CK19的表达是HCC重要的预后不良指标。大量研究表明，在HCC中，TAM与CSCs之间存在很强的通讯。但是CK19+ CSCs及TAMs的亚型在HBV相关的HCC中的作用尚未得到充分研究。

技术路线

通过手术切除11例HBV相关HCC患者的新鲜肿瘤组织样本(包括7例CK19阳性和3例CK19阴性)和5例相邻的正常组织样本进行单细胞测序。96例HBV相关HCC患者(191个样本)进行Bulk RNA测序作为验证队列1，89例复发的原发性HCC样本进行Bulk RNA测序作为验证队列2。

研究结果

1.HBV相关CK19+ HCC的scRNA-seq分析

scRNA-seq分析共鉴定出11种不同的细胞类型。非免疫细胞主要包括内皮细胞、肝星状细胞，正常上皮细胞和恶性细胞，免疫细胞包括髓源性细胞、浆状树突状细胞、T细胞、自然杀伤细胞、B细胞、浆细胞和中性粒细胞(图1a-c)。此外，结果显示，恶性细胞(46.8%)和髓源性细胞(32.1%)是肿瘤组织的主要组成部分，在CK19阳性和阴性HCC样本中表现出不同的聚类和分布(图1d, e)。这些结果表明，髓源性细胞可能在CK19阳性HCC患者中具有独特的功能作用。

图 1基于scRNA-seq的HBV相关CK19+ HCC分析研究流程示意图

2.CK19+癌细胞的分子异质性

肿瘤细胞分为9个不同的亚群(图2a)。来自CK19-HCC患者的恶性细胞主要分布在cluster_1和cluster_3。CK19+ HCC患者的恶性细胞主要分布在其他7个簇 (图2b)。根据CK19基因在不同簇中的表达水平(≥5%)，将cluster_0、cluster_4、cluster_5、cluster_7和cluster_8定义为CK19阳性簇(图2c)。

GSVA结果显示，在cluster_0、cluster_4、cluster_5和cluster_8中，MYC-targets、糖酵解和mtorc1信号通路被激活，而在cluster_7中，EMT、Kras和notch信号通路被显著激活(图2d)。此外，pySCENIC分析显示cluster_0、cluster_4、cluster_5和cluster_8聚类在一起，高表达MYC、TGIF2、SMARCB1、XBP1和ATF5。cluster_7中的主要转录因子包括SOX9、HOXC10、ZNF217、KMT2A和FOXO3(图2e)。这些结果提示CK19阳性恶性细胞群具有显著的表型异质性，这可能为HCC患者的准确治疗提供新的视角。

图 2 CK19+ HCC的异质性

3.CK19+ CSCs的干性特征

根据肿瘤干性标志物的表达，CK19+恶性细胞中干性标志物表达水平更高，其中 cluster_4、cluster_5、cluster_8和cluster_0具有相似的表达特征， cluster_7为另一种表达特征，这些群即为CK19+ CSCs(图3a)。采用多重免疫荧光染色(mIF)也验证了干性基因的共表达(图3b)。

进一步的细胞系实验表明，与CK19-Huh-7组相比，CK19+ Huh-7组在第18天和第20天的肿瘤体积显著增加 (图3c)。与sh-CK19 NC相比，sh-CK19-huh -7组在第15天、第18天和第20天的肿瘤体积显著减少(图3c)。与对照组相比，CK19 + Huh-7在创面愈合和Transwell侵袭实验中表现出更强的迁移和侵袭能力 (图3d,e)。CK19+ Huh-7组中CK19、SOX9、CD44、EPCAM、PROM1、CD24等6种干性生物标志物的蛋白表达水平显著升高 (图3f)。这些结果表明，CK19+恶性细胞具有较强的干性、迁移、侵袭和肿瘤形成特征。

图 3 CK19+ CSCs的干性特征

4、MMP9来源于TAM，是CK19+ HCC的枢纽基因

在验证队列1和TCGA队列中，对CK19基因的高、低表达水平进行DEG分析，加权基因共表达网络分析(WGCNA)获得了5个共表达基因模块(图4a)。蓝绿色模块与CK19基因及蛋白表达水平具有最高的相关性 (图4b)。在TCGA数据库中，从374例肝癌患者中筛选了74例HBV相关的HCC样本。分析CK19基因低表达组和高表达组的DEG，这些基因与蓝绿色模块中显示1009个共同的基因(图4c)。然后进行蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络分析鉴定出MMP9、CXCL8、CCL2、TGFB1和TIMP1为核心基因(图4d)。在单细胞结果中表明CK19阳性HCC样本中，MMP9主要在髓源性细胞中显著高表达(图4f)。生存分析显示MMP9高表达的样本预后较差(图4g)。综上，具有蛋白水解活性的MMP9可能通过调节肿瘤细胞的血管生成、迁移、EMT和存活在肿瘤发生过程中发挥重要作用。

图 4 来源于TAM的MMP9作为CK19+ HCC的枢纽基因

5、TAM_SPP1高表达MMP9，在CK19+ HCC中特异性富集且有不良的预后

髓系来源细胞分为7类(图5a)，其中TAM_SPP1在CK19+ HCC中显著富集(图5b)。在蛋白水平上使用mIF(图5d)得到证实。且MMP9主要表达于TAM_SPP1亚群(图5e)。与对照组相比，CK19+ Huh-7和sh-CK19-Huh-7细胞诱导的巨噬细胞中MMP9的表达水平分别显著升高和降低 (图5g)。这些结果进一步证明CK19+ CSC可能诱导巨噬细胞转化为TAM_SPP1，分泌MMP9。这表明TAM_SPP1生态位在CK19+ HCC的生物学行为中发挥了重要作用。验证队列1(图5h)和验证队列2(图5i)中TAM_SPP1高富集的患者生存期较短。提示TAM_SPP1可作为HCC患者预后不良的生物标志物。

图5 TAM_SPP1高表达MMP9，在CK19+ HCC中特异性富集且有不良的预后

6、TAM_SPP1促进CK19+ HCC的侵袭转移

根据M1,M2特征基因表达发现TAM_SPP1是M2样巨噬细胞 (图6a, b)， TAM_SPP1在CK19阳性HCC患者中具有更强的M2样特征(图6d)。CK19 + HCC患者TAM_SPP1的血管生成、EMT、缺氧和Kras信号通路被显著激活(图6e, f)。这些结果表明TAM_SPP1可能在肿瘤的侵袭和转移中起关键作用。临床数据进一步证明了它们促进转移的能力，在验证队列1中，与微血管侵袭(MVI)阴性HCC相比，TAM_SPP1在微血管侵袭(MVI)阳性HCC中显著富集(图6g)。血管侵袭与肿瘤复发密切相关，生存分析显示TAM_SPP1与肿瘤复发呈正相关。

图6 SPP1阳性肿瘤相关巨噬细胞(TAM_SPP1)促进CK19+ HCC细胞的侵袭和转移

7、VEGFA信号通路促进了TAM_SPP1中MMP9的表达

CellphoneDB结果显示，在CK19+ HCC中，细胞相互作用明显高于对照组，这表明CK19+ HCC可能重编程并诱导TAM_SPP1呈现一定的功能状态。在CK19+ HCC中，肿瘤细胞可能通过VEGFA/FLT1与TAM_SPP1发生配体受体相互作用(图7b)。有趣的是，NicheNet分析预测出CK19阳性肿瘤细胞来源的VEGFA可以激活TAM_SPP1中的MMP9(图7c)。与CK19阳性组相比，在肿瘤细胞中，CK19阳性组的VEGFA表达水平更高(图7d)，在TAM_SPP1中CK19阳性组的FLT1表达水平更高(图7e)。通过mIF实验进一步验证了这些观察结果 (图7f)。这些发现提示，VEGFA信号的激活可能促进TAM_SPP1细胞分泌MMP9，其可能在细胞外基质中发挥重要作用，促进肿瘤侵袭转移。这提示TAM_SPP1和MMP9可能作为HCC患者的有效治疗靶点。

图7 VEGFA信号通路促进了TAM_SPP1中MMP9的表达

结论

本研究揭示了CK19+ HCC中CK19+ CSCs的异质性和干性特征，以及特异性免疫抑制TAM_SPP1。结合Bulk RNA测序筛选到MMP9作为枢纽基因，通过细胞通讯分析发现CK19阳性肿瘤细胞的VEGFA信号可以激活TAM_SPP1分泌的MMP9，促进CK19+ HCC肿瘤的侵袭转移。综上，TAM_SPP1和MMP9是HCC潜在的预后生物标志物和治疗靶点，本研究可能为HCC患者的临床治疗提供新的见解。

参考文献

Yang CL, Song R, Xiang BD, et al. Integrating single-cell and bulk RNA sequencing reveals CK19 + cancer stem cells and their specific SPP1 + tumor-associated macrophage niche in HBV-related hepatocellular carcinoma. Hepatol Int. 2024 Feb;18(1):73-90. doi: 10.1007/s12072-023-10615-9.