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项目文章 | 单细胞多组学全面构建再生障碍贫血免疫调控网络

发布时间：2024-03-28 10:38:20

郑州大学第一附属医院血液内科郭荣群和李英梅团队联合其他多个科研团队在Advanced Science期刊上在线发表题为“Unbiased Single-Cell Sequencing of Hematopoietic and Immune Cells from Aplastic Anemia Reveals the Contributors of Hematopoiesis Failure and Dysfunctional Immune Regulation”的研究论文。该研究结合单细胞转录组测序和流式质谱技术，从RNA、蛋白、代谢和细胞水平构建了一个全面的再生障碍贫血(Aplastic Anemia, AA)免疫调控网略，为揭示AA患者的整体免疫微环境提供了数据支撑，为AA的临床治疗新方案的开发提供新的思路。

新格元在该研究中提供了GEXSCOPE^®单细胞转录组测序。

下面和元小新一起来看看吧~

研究背景

再生障碍贫血是作为一种常见的骨髓衰竭性疾病，通常伴以严重的全血细胞减少等症状。再生障碍贫血的发病原因主要为异常活化的T淋巴细胞攻击造血干细胞/祖细胞(hematopoietic stem/progenitor, HSPCs)，在这一过程中机体免疫稳态调控网络失效，从而导致骨髓衰竭。近年来对再生障碍贫血的单细胞研究发现，除了T淋巴细胞之外，其他免疫细胞如B细胞、NK细胞也出现功能上的异常；但多数研究关注于某一类免疫细胞在再生障碍贫血中的作用，对骨髓中全面的免疫细胞状态、免疫细胞之间以及免疫细胞与造血干细胞之间的相互作用缺乏一个整体、全面的了解，这就阻碍了再生障碍贫血的深入机制研究和临床治疗方案的优化。

研究结果

1.单细胞转录组、流式质谱、细胞因子筛选和代谢组学解析AA骨髓和免疫微环境

作者通过单细胞转录组、流式质谱、细胞因子筛选和代谢组学技术对来自再生障碍贫血患者(9位患者13例样本)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症患者(3位患者4例样本)和健康对照(4位患者8例样本)的骨髓和外周血样本进行全面的多组学分析。结果发现，T淋巴细胞在AA患者骨髓中有明显的累积，而基质细胞是骨髓微环境中细胞间相互作用的重要参与者。细胞因子分析发现，巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF、IL-1𝛽 、IL-4等细胞因子仅在部分AA患者骨髓中高表达，肿瘤坏死因子TNF-α和干扰素γ的表达并没有显著升高，这也暗示传统的抗TNF的治疗方式并不能作为统一的AA治疗方案。

图1 多组学解析AA骨髓和免疫微环境

2.异常激活的CD8⁺ T细胞通过细胞凋亡和细胞焦亡导致HSPCs死亡

作者对CD8⁺ T细胞作进一步的细分和功能分析，发现表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIRs)的CD8⁺ T细胞(KIR+CD8⁺ T)在AA患者中占比显著升高；AA患者骨髓CD8⁺ T细胞中TNF和TNFSF12的上调表明TNF-TNFR1介导的细胞死亡可能参与到HSPCs细胞的死亡中。AA患者HSPCs中GSDME的上调表示激活的CD8⁺ T细胞释放了颗粒酶B和穿孔素，这些分子进一步诱导HSPCs细胞焦亡的发生，这在AA中是一种全新的CD8⁺ T细胞介导HSPCs细胞死亡的模式。

图2 异常激活的CD8⁺ T细胞介导HPSCs的细胞焦亡

3.CD4⁺ Tregs细胞的免疫抑制和迁移功能受到抑制

作者对CD4⁺ T细胞的分化以及极化做进一步分析，发现骨髓中滤泡型辅助T细胞(TFH)和TH-1样TH17细胞是病理性的免疫细胞类型。细胞因子分析发现骨髓浆细胞中IL-4/13上调，有力地说明了2型炎症介导的TH2模式，是AA病理特征之一。

与健康对照相比，AA患者骨髓中静息型Treg亚群占比明显降低，免疫抑制分子的表达处于低水平；AA患者骨髓中Tregs高表达细胞凋亡相关的基因，而抗细胞凋亡的基因表达则处于很低的水平。另外，AA患者Tregs中与细胞迁移相关的基因表达降低表明，AA患者中Tregs细胞的免疫抑制和迁移功能受到影响。

图3 CD4+ Tregs细胞的免疫抑制和迁移功能受到抑制

4、AA患者中病理性Vδ1 T细胞占比增多

对NK细胞、NKT细胞以及γδ T细胞这几类特殊T细胞亚群进行分析，发现这几类细胞类型在AA患者中占比都明显升高，对γδ T细胞亚群分析，确认δ1样T细胞亚型是AA患者骨髓中占优势的亚型，表明该亚型可能是病理性的。

图4 AA患者中病理性VδT细胞占比增多

5、B细胞和红系祖细胞出现明显的细胞死亡表型

作者对B细胞和浆细胞进行进一步的细分分析，发现AA患者骨髓B细胞和浆细胞具有较高的细胞凋亡和细胞焦亡活性，增殖型的浆细胞也表现出FAS介导的细胞凋亡特征。

对骨髓来源红细胞进行分析，得到处于4个不同发育阶段的红细胞亚群，处于早期发育阶段的红系祖细胞在AA患者中占比减少，而处于发育末端的亚群占比明显上升。发育早期的红细胞亚群高表达FAS、TNFRSF1A和TNFRSF12A等基因，说明红细胞祖细胞对于外源性的细胞凋亡信号更为敏感。CD8⁺ T细胞介导的细胞死亡是红系祖细胞减少的原因，这可能会进一步影响NK细胞的发育和稳态。

图5 B细胞和红系祖细胞出现明显的细胞死亡表型

6、铁死亡通路驱动的细胞死亡导致AA患者造血功能衰竭

铁离子过载是AA患者中比较明显的特征，对AA患者血清铁蛋白水平的检测证实了这一特征。相比其他细胞类型，HSPCs对铁死亡更为敏感，HSPCs和祖细胞中谷胱甘肽过氧化物酶基因GPX4的表达显著高于其他细胞类型。氧化脂肪酸(OFA)是铁死亡的一个表征因子，通过对AA患者骨髓浆液的代谢组学分析发现，多种OFA分子水平升高。AA患者骨髓中CD34⁺ HSPCs中活性氧ROS水平显著高于健康对照中，但是CD3⁺ T细胞中并没有观察到这一现象，说明HSPCs可能缺乏抗铁死亡的能力。这些发现表明，铁死亡是AA患者中造血功能的一个负向调节因素。

图6 铁死亡通路驱动的细胞死亡导致AA患者造血功能衰竭

7、同卵双生AA患者的HSCT治疗案例为AA致病机制提供新见解

通过对一个同卵双生、均患AA的双胞胎患者(先证者接受健康者的HSPCs进行HSCT治疗，4年后健康者患AA)进行分析，发现经过HSCT之后，AA患者中血细胞比容、网织红血球、白细胞、中性粒计数等指标恢复正常，表明造血功能得到恢复。

对这对双胞胎AA患者在不同时间点的外周血和骨髓进行单细胞转录组分析，发现造血功能的恢复伴随着HSPCs细胞占比的升高和T/NK细胞的减少。红细胞生成功能在HSCT治疗后24天或者更早的时期得到恢复。这一双胞胎AA患者的案例研究为AA致病机制的“seed-soil-worms”理论提供了新颖的见解。

图7 同卵双生AA患者的HSCT治疗案例为AA致病机制提供新见解

结论

本研究通过对AA患者外周血和骨髓样本的多组学分析，全方位解析了AA微环境免疫细胞、造血干细胞的变化和相互作用，鉴定出免疫反应的外源性驱动因素，并进一步验证铁死亡引起的铁离子失衡导致HSPCs造血功能的失调，为未来的再生障碍性贫血治疗方案革新带来了一定启示。

参考文献

Rongqun Guo, Jingjing Kong, Ping Tang, et al. Unbiased Single-Cell Sequencing of Hematopoietic and Immune Cells from Aplastic Anemia Reveals the Contributors of Hematopoiesis Failure and Dysfunctional Immune Regulation.Adv Sci (Weinh). 2023 Dec 25:e2304539. doi: 10.1002/advs.202304539. Online ahead of print.

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