2023年，江苏省中西医结合医院曹萌/曹鹏团队在国际肿瘤学期刊J Exp Clin Cancer Res期刊(IF：11.3)上发表了题为“Ginseng-derived nanoparticles reprogram macrophages to regulate arginase-1 release for ameliorating T cell exhaustion in tumor microenvironment”的研究成果。该研究根据体外WB、PCR、ELISA和流式细胞术等多种技术观察到人参囊泡(Ginseng-derived nanoparticles，GDNPs)重编程的TAM抑制ARG1释放并最终改善T细胞耗竭。并通过新格元GEXSCOPE®单细胞转录组测序(scRNA-Seq)技术发现了GDNPs通过增强CD8Teff的效应功能改善T细胞耗竭。利用生物信息学工具和流式细胞术进一步阐明了GDNPs改善T细胞耗竭的机制。这些发现为理解T细胞耗竭的缓解机制提供了新见解，有助于癌症治疗领域创新治疗策略的开发。
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研究背景
免疫检查点(IC)抑制剂增强T细胞免疫反应以发挥抗肿瘤作用。然而，T细胞耗竭一直是结直肠癌患者抗肿瘤免疫治疗的主要障碍。作者之前的研究表明，人参囊泡(GDNPs)通过重编程肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)并下调肿瘤微环境(TME)中T细胞上ICs的表达来抑制多种肿瘤的生长，但其潜在的效应机制仍不清楚。
技术路线
研究结果
1.ARG1与肿瘤进展和T细胞免疫检查点增加密切相关
在TME中，高水平的ARG1表达促进肿瘤生长和转移。使用在线平台分析发现在结直肠癌、乳腺癌、皮肤黑色素瘤等肿瘤中检测到ARG1高表达(图1A)。此外，在结直肠癌中ARG1与TIM3、TIGIT、ICOS呈正相关，证明了ARG1抑制T细胞免疫反应这一观点。结直肠癌小鼠模型肿瘤中免疫细胞的单细胞测序分析表明，ARG1主要在巨噬细胞中表达(图1C-F)，表明肿瘤相关巨噬细胞(TAM)可能是MC38肿瘤中ARG1产生的重要来源，与结直肠癌中的免疫检查点和T细胞耗竭有关。
图1. ARG1与肿瘤进展和T细胞上免疫检查点表达增加密切相关
2.GDNPs重新编程TAM以减少ARG1表达
有研究表明，M2样巨噬细胞占TAM的大部分。作者之前的研究发现GDNPs通过将TAM重编程为M1样巨噬细胞，有效抑制小鼠体内多种肿瘤的生长。为了进一步研究GDNPs对巨噬细胞的影响，首先制备了GDNPs(图2B)。接下来，对用或不用GDNPs处理的M2样巨噬细胞进行bulk RNA测序，结果显示GDNPs使得M2样巨噬细胞中M1相关基因的上调和M2相关基因的下调(图2C)。Pearson相关分析显示GDNPs将M2样巨噬细胞重编程为M1样巨噬细胞(图2D)。实时定量PCR测定(图2E)和蛋白质印迹测定(图2F)表明， GDNPs使M2样巨噬细胞中代表性标记物ARG1减少。使用ELISA技术检测发现GDNPs抑制M2样巨噬细胞释放ARG1(图2G)。空间代谢组学数据显示GDNPs使结肠肿瘤模型内精氨酸代谢途径发生了显著变化(图2H)，这可能与GDNPs诱导巨噬细胞重编程过程中ARG1释放的减少有关。总体而言，GDNPs通过将M2样巨噬细胞极化为M1样巨噬细胞来下调ARG1的产生。
图2. GDNPs重新编程TAM以减少ARG1的产生
3.GDNPs通过极化TAM来减少ARG1的产生，从而促进T细胞的增殖和激活
ARG1参与精氨酸代谢途径并分解精氨酸。精氨酸代谢对于T细胞的活性和反应非常重要。与对照相比，用GDNPs处理后M2样巨噬细胞上清液中的精氨酸水平更高(图3A)。作者建立了一个培养体系来探讨GDNPs是否可以维持TME中的精氨酸水平并增强T细胞的免疫反应(图3B)。GDNPs治疗组中脾细胞分泌的IFN-γ最高(图3C)。T细胞增殖实验显示，当GDNPs添加到M2样巨噬细胞中时，CD4+和CD8+T细胞的抑制得到减轻(图3D)，并且增殖率比未处理的M2样巨噬细胞上清液高3倍(图3E,F)。
作者使用流式细胞术检测了与不同的M2样巨噬细胞上清液孵育的T细胞上免疫检查点的表达。结果显示，GDNPs使CD4+和CD8+T细胞上ICOS、PD-1、TIGIT表达显著下降。此外，CD8+T细胞上TIM3表达显著降低(图3G，H)。为了分析免疫检查点变化的原因，作者还检测了T细胞中的转录因子Eomes、Tox和T-bet。与对照相比，GDNPs治疗组CD4+T细胞中的Tox表达较低(图3I)。GDNPs和nor-NOHA治疗组中CD8+T细胞中T-bet的表达较高(图3J)。总的来说，这些数据表明GDNPs引起的巨噬细胞极化可以增强T细胞活化并改善T细胞耗竭，主要是通过下调ARG1水平来改善精氨酸代谢。
图3. GDNPs通过极化TAMs减少ARG1的产生以促进T细胞的增殖和活化
4、GDNPs改善TME中的精氨酸代谢，从而改善T细胞耗竭
接下来，作者研究了GDNPs治疗在体内是否具有类似的效果，以及这种效果是否有利于抗肿瘤免疫反应。为此，通过将MC38结肠癌细胞皮下接种到小鼠来建立荷瘤模型(图4A)。与对照相比，GDNPs治疗显著抑制了肿瘤生长(图4B)。
进行FACS分析以评估TME免疫细胞中ARG1的表达。结果表明，用GDNPs处理后，巨噬细胞和骨髓源性抑制细胞(MDSC)中的ARG1表达显著降低(图4C)。同时，GDNPs组的精氨酸水平(图4D)以及M1/M2比率较高(图4E)。这些数据表明，GDNPs可以通过重新编程TAM抑制ARG1的产生来维持精氨酸水平，从而促进其抗肿瘤作用。
为了研究GDNPs、ARG1和T细胞耗竭之间的相互作用，作者检查了T细胞活化、增殖和免疫检查点的表达。流式细胞术结果显示，与对照相比，GDNPs处理显著上调CD4+和CD8+T细胞中CD69和Ki67的表达,同时下调ICOS、PD-1、TIGIT、TIM-3的表达。(图4F-I)。为了进一步确定GDNPs对缓解T细胞耗竭的潜在影响，作者评估了T细胞中转录因子Eomes、Tox和T-bet的表达(图4J,K)。结果显示，GDNPs抑制CD4+和CD8+T细胞中Eomes和Tox的表达，但仅增强CD8+T细胞中T-bet的表达。总之，GDNPs通过促进T细胞活化增殖和减轻T细胞耗竭来发挥抗肿瘤作用。
图4. GDNPs改善TME中的精氨酸代谢以缓解T细胞耗竭
5、GDNPs通过增强CD8Tef的作用功能改善T细胞耗竭
为了探索GDNPs如何影响CD8+T细胞亚群以进一步减轻T细胞耗竭，作者使用单细胞测序来检测GDNPs给药后T细胞的变化。对CD8+T细胞聚类分群为三种不同的亚型：初始T、CD8效应T细胞(CD8Teff)和CD8耗竭T细胞(CD8Tex)(图5A,B)。细胞毒性和趋化因子相关基因在GDNPs处理的CD8Teff和Tex亚簇中表现出更高的表达水平(图5C)。
此外，使用效应基因集进行UCell分析发现GDNPs不仅增强了CD8Teff的细胞毒性效应功能，而且增强了CD8Tex和naiveT的细胞毒性效应功能(图5D-F)。热图结果表明，GDNPs下调CD8Teff细胞中Tox、Eomes的表达，上调Tbx21的表达。CD8Tex中的Tox和Eomes也观察到相同的结果(图5G)。总之，GDNPs通过改善CD8Teff中的tbx21表达来增强效应器功能，从而改善T细胞耗竭。
图5. GDNPs通过增强CD8Teff的功能缓解T细胞耗竭
6、GDNPs对T细胞耗竭的改善效果取决于mTOR-T-bet轴
以上的研究表明，GDNPs通过调节ARG1表达来影响TME中的精氨酸水平，并且作者发现GDNPs增加了T细胞中T-bet的表达从而改善了精氨酸代谢。因此作者推测GDNPs对T细胞耗竭的改善可能也与调节精氨酸代谢的mTOR信号通路有关。为此，作者构建了一个培养体系，将CD8+T细胞与M2+GDNPs或M2巨噬细胞上清液一起培养后收集CD8+T细胞进行转录组测序。KEGG富集分析显示mTOR信号通路存在显著差异(图6A)。为了进一步探讨GDNPs改善T细胞耗竭的机制，作者将脾细胞与经或不经GDNPs处理的M2样巨噬细胞上清液一起孵育，结果显示，GDNPs处理后T细胞中p-S6和p-4EBP1的表达显著增加，表明mTOR信号的激活增强(图6B-D)。
精氨酸被认为是mTOR通路的激活剂。为了进一步验证精氨酸对mTOR活性的增强作用，使用流式细胞术分析发现精氨酸增加了CD8+T细胞中p-S6和p-4EBP1的表达(图6E-G)。此外，流式细胞术分析表明，精氨酸降低了CD4+T细胞和CD8+T细胞中Tox的表达，增加了T-bet的表达。而精氨酸对Eomes表达的影响仅在CD4+T细胞中发现(下调)，而在CD8+T细胞中则没有(图6H-J)。为了测试补充精氨酸是否可以通过调节这些转录因子来改善T细胞耗竭，作者通过流式细胞术检测了有或没有精氨酸培养的T细胞上ICOS、PD-1、TIGIT、TIM3的表达。结果表明，补充精氨酸降低了CD4+和CD8+T细胞上PD-1、TIGIT和TIM3的表达，这证实补充精氨酸可以改善T细胞耗竭(图6K-M)。因此，GDNPs通过极化巨噬细胞来改善精氨酸代谢，从而防止T细胞耗竭。
图6. GDNPs对T细胞耗竭的缓解作用依赖于mTOR-T-bet轴
7、抑制T细胞中的mTOR活性可抑制GDNPs的抗肿瘤作用
为了进一步阐明GDNPs是否通过mTOR-T-bet轴改善T细胞耗竭，作者使用mTOR活性抑制剂雷帕霉素来检查改善的T细胞耗竭是否主要受mTOR信号通路调节。因此，作者利用M2样巨噬细胞的上清液与GDNPs加雷帕霉素建立了脾细胞培养体系，以抑制mTOR活性。流式细胞术结果显示，与单独使用M2+GDNPs相比，添加雷帕霉素时T细胞上ICOS、PD-1、TIGIT的表达比例显著升高(图7A,B)。与未使用雷帕霉素的组相比，经雷帕霉素处理的CD8+T细胞中Tox表达较高，而雷帕霉素存在时T-bet表达较低(图7C,D)。同时，作者进行了体内验证，通过T细胞回输实验(图7E)表明，雷帕霉素处理后GDNPs失去了抗肿瘤作用(图7F)。总之，这些结果表明GDNPs改善T细胞耗竭依赖于mTOR-T-bet途径(图7G)。
图7. 抑制T细胞中的mTOR活性抑制GDNPs的抗肿瘤作用
结论
总的来说，该研究发现药用植物人参的纳米囊泡可以通过编程巨噬细胞调节ARG1的释放以改善肿瘤微环境中T细胞的耗竭，恢复T细胞的抗肿瘤作用，更好地治疗结直肠癌。同时该研究也为更好地推广免疫检查点抑制剂以这种方式治疗肿瘤提供了新的策略。
参考文献
Lv Y, Li M, Weng L, et al. Ginseng-derived nanoparticles reprogram macrophages to regulate arginase-1 release for ameliorating T cell exhaustion in tumor microenvironment. J Exp Clin Cancer Res. 2023 Nov 28;42(1):322. doi: 10.1186/s13046-023-02888-7.
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