新格元在该项研究中承担FocuSCOPE®靶向高通量单细胞测序等工作。
下面和元小新一起来看看吧~
项目文章Nat. Commun | 单细胞测序揭示急性早幼粒细胞白血病的干细胞样细胞和早期死亡风险
发布时间：2024-05-07 13:30:33
2024年2月，上海交通大学医学院附属瑞金医院 上海血液学研究所 王侃侃研究员、方海研究员以及陈竺院士共同通讯在《Nature Communications》杂志上在线发表题为“Cellular hierarchy insights reveal leukemic stem-like cells and early death risk in acute promyelocytic leukemia”的研究论文。该研究中利用新格元FocuSCOPE®靶向高通量单细胞测序技术对APL关键致病因子PML/RARα以及FLT3-ITD突变进行靶向捕获，获得单个细胞层面的融合基因和突变信息，进而证实APL原始肿瘤细胞的身份。在此基础上，阐明PML/RARα在调控APL原始细胞瘤内异质性方面的关键作用，特别强调PML/RARα对识别的干细胞样细胞的影响。
研究背景
急性早幼粒细胞白血病(Acute promyelocytic leukemia，APL)是急性髓细胞白血病(AML)的一种特殊类型，占急性髓系白血病的5%-15%。APL具有特殊的染色体易位t(15；17)(q22；q12)，从而形成PML-RARα异常融合基因，其蛋白产物导致造血细胞分化阻滞在早幼粒细胞阶段。全反式维甲酸(ATRA)和三氧化二砷(ATO)联合靶向分化治疗APL已取得显著成果，但仍有少量患者治疗失败，甚至发生早期死亡。细胞水平的肿瘤内异质性是白血病发生进展和治疗反应的关键因素，在APL的背景下，探索由相同的致癌驱动因素PML/RARα驱动的白血病细胞是否表现出不同的细胞状态以及对治疗的影响是极其重要的。
技术路线
研究结果
1.APL原始细胞的单细胞表征
作者收集16名新诊断的APL患者的骨髓样本进行scRNA-seq，其中的两例样本使用单细胞靶向测序(scTarget)，并收集23例正常骨髓样本的单细胞数据作为正常对照进行联合分析，以表征恶性APL原始细胞和肿瘤内异质性。
整合分析显示，来自APL患者的淋巴细胞和红细胞等形成与正常骨髓相对应的簇，而APL原始细胞(cluster1)仅在APL中存在，通过scTarget检测PML/RARα在该簇中表达，证实APL原始细胞鉴定的准确性(图1b)。其次，已知的APL标志物在该簇中高度表达，例如PML/RARα相关超级增强子激活基因(STAB1、CITED2、CCND2、GFI1)。该簇还表现出GMP特异性基因的表达水平显著升高(MPO、AZU1、ELANE和CTSG)，支持APL原始细胞可能阻断在GMP阶段的观点(图1d)。
与GMP相比，APL原始细胞显示出“HSC自我更新/分化、组蛋白修饰、DNA甲基化、细胞周期停滞和细胞生长、对内质网应激和未折叠蛋白的反应”等通路的上调(图1e)以及免疫应答相关功能的下调(图1f)。
APL中造血TF和辅助因子(SPI1、ERG、FOS和RXRA)、干扰素信号介质(STAT1、IRF8和IRF1)被抑制。致癌TF(RB1、HIF1A和MAX)、表观遗传调节因子(SMAD4、MBD1、YY1和SP3)和细胞增殖相关TF(RNF6、ELF2和TOP2B)被激活，表明了APL原始细胞的分化阻断和高度增殖状态(图1g)。
图1 通过综合分析APL和正常骨髓细胞的scRNA-seq数据表征恶性APL原始细胞
2.APL原始细胞的肿瘤内异质性和细胞状态转换轨迹
APL原始细胞重新聚类为18个簇，C14-16表现出干性样特征(CD200、CD44、CD99、CD2和FAM30A高表达)，且C15的表达水平更高，可能代表白血病干细胞样细胞(图2a,b)。
RNA速率分析显示，Stem-like(C15)位于分化轨迹的根部并经过Prog-like分支(C14)，产生三个主要分支：GMP-like分支(C1-C5和C13)，Cycling GMP-like分支(C6-C10)和S100hiGMP-like分支(C11和C12)(图2c,d)。该结果在Monocle2伪时间排序轨迹分析也被证实(图2e)。RUNX1、RUNX2和干扰素相关因子STAT1和FOS可能参与GMP-like分化轨迹，而CEBP家族成员、MAFB、JUNB和JUND可能与S100hiGMP-like的谱系决定有关(图2f)。
PML/RARα靶向scRNA-seq证实PML/RARα在APL原始细胞的所有六个分支中均有均匀表达，包括在干细胞样细胞簇中的显著表达(图2g,h)。每个分支都拥有大量不同的PML/RARα靶基因，表明APL轨迹中存在PML/RARα靶基因的分支特异性表达模式(图2i)。
GO分析发现Stem-like细胞中PML/RARα靶基因主要参与干细胞维持。Cycling GMP-like中主要与参与G2-M检查点的E2F靶标有关。GMP-like中核糖体功能明显富集(附图)。这些结果共同阐明了PML/RARα在塑造APL瘤内异质性方面的重要调控作用。
图2 APL原始细胞的肿瘤内异质性和分化轨迹表征
3.APL干细胞样细胞的特性由PML/RARα靶基因决定，FLT3-ITD可进一步增强
与HSPC相比，PML/RARα靶基因在APL Stem-like细胞中显著富集。白血病干细胞标记基因 (FCGR2A、CD9)、干性/自我更新相关的基因(HCK、GFI1)、与APL发生密切相关的基因(FLT3、JAG1)在APL Stem-like细胞中表达，这些也是PML/RARα的靶基因(图3a,b)。GO富集分析确定白血病干细胞相关通路，包括经典的WNT、MAPK、VEGF、P53和mTOR信号转导等，这些对于维持白血病干细胞种群都至关重要(图3c)。
干性相关的TF(如TGIF1和HIF1A)在APL Stem-like细胞中被激活，表明在调节APL细胞干性方面的潜在作用。组蛋白修饰相关因子(MBD2/3和PRDM2)的激活可能表明参与APL Stem-like细胞的自我更新和静止的表观遗传机制。与恶性转化和干性特性相关的TF(如OLIG2和ARID3B)也具有活性，这些发现强调了PML/RARα在单细胞水平上调节 APL 干细胞样细胞的关键作用(图3d)。
把APL原始细胞的细胞组成与APL常见的协同遗传学改变联系起来，携带FLT3-ITD突变患者具有更高比例的干细胞样细胞群体，表明FLT3-ITD的存在可能增强白血病干性(图3e)。两种干性评分结果也显示具有FLT3-ITD的干细胞样细胞的干性明显高于没有FLT3-ITD的干细胞(图3f)。FLT3-ITD靶向scRNA-seq进一步明确了其在APL干细胞样细胞中的高表达(图3g,h)。
图3 PML/RARα和FLT3-ITD在调节APL干细胞样细胞特性中的关键作用
4、APL干性评分对APL早期死亡和治疗效果的预测能力
建立了基于反卷积的预测程序来探讨如何利用scRNAseq定义的APL干细胞样细胞来预测APL的临床障碍，更准确地预测早期死亡的发生、风险分层和治疗效果。该算法原理图如图4a所示，首先将 CIBERSORTx 算法 应用于 scRNA-seq 数据，生成了 APL 特异性特征矩阵。第二步，从bulk RNA-seq数据中准备了外显子模型每百万映射读数(TPM)的每千碱基转录本矩阵。第三步，使用支持向量回归(SVR) 对特征矩阵和 TPM 矩阵进行解卷积，得到一个系数矩阵。利用各细胞类型在系数矩阵中的占比建立线性回归模型进行基准测试。第四步，通过LASSO构建了一个11基因评分模型，从bulk RNA-seq数据中评估APL原始细胞的干性，得分越高表明干性越高。此外，设计了一个留一检验来证明推断的APL干细胞样细胞比例的稳健性(图4b)。利用作者建立的反卷积方法可以从bulk APL转录组中准确预测APL干细胞样细胞。
图4 APL干性评分的构建
接着利用建立的反卷积预测程序探讨APL干细胞样细胞与APL患者临床特征的相关性。首先，较高比例的APL Stem-like细胞与白细胞(WBC)计数升高和血小板计数较低显著相关。其次，较高比例的APL Stem-like细胞与S型PML/RARα转录本以及FLT3-TD突变显著相关(图5a)。
进而运用LASSO机器学习技术构建了APL特异性的干性评分系统。经过深入分析发现，较高的APL干性得分与较差的总体生存期(OS)、无事件生存期(EFS)和早期死亡风险显著相关(图5b-d)。这些结果共同凸显了APL干性评分系统在评估APL风险方面的重要价值。
图5 APL干性评分预测APL预后及早期死亡的信息性
5、ATRA对APL原始细胞分化的体内影响及其对早期死亡风险的影响
进一步研究了全反式维甲酸(ATRA)治疗对于APL细胞层次结构的影响，尤其是APL原始细胞。分析3名经过ATRA治疗2天患者的scRNA-seq的数据(APL03-05)。治疗后，显著增加偏成熟祖细胞的比例，并下降三种更原始细胞类型的比例(Stem-like、Prog-like和S100hiGMP-like)，Stem-like细胞在治疗后几乎检测不到，表明ATRA对APL更原始细胞，尤其是干细胞样细胞有显著影响(图6a-d)。治疗后样本的分化成熟度评分更高(图6e)。在完全缓解的APL患者ATRA治疗前后的bulk RNA-seq数据中也获得了类似的结果(图6f)。
原始细胞类型中APL干性标志物(如CD200、CD34、FCGR2A/CD32、CD9、IL3RA/CD123)和TF(如HHEX、MYC、JAG1、ERG)显著下调。相反，与分化成熟造血细胞谱系相关的标志物和TF在ATRA治疗后上调：如CD38、CD84、CEBPA和ELF4在Prog-like细胞中上调；ITGAM/CD11b、C5AR1、TFEC和MAFB在S100hiGMP-like细胞中上调；CD24、CEACAM6、CEBPE和CEBPB在GMP-like细胞中上调。表明ATRA可诱导APL干细胞样细胞向更成熟的细胞发展(图6g,h)。
然而在早期死亡的患者中未观察到几种干性相关CD标志物和TF(HHEX、NFATC2)的下调和分化相关标志物的上调(图6i,j)，因此ATRA治疗对早期死亡APL患者的干性影响较小，可能解释了白血病细胞干性活性与早期死亡之间的显著关联。
图6 体内分析显示ATRA直接靶向APL原始细胞并诱导其分化和成熟
结论
scRNA-seq分析揭示了一小部分APL特异性的干细胞样白血病细胞(C15)，表达干性标志物(CD200、CD99和CD9)和PML/RARα，位于APL层次结构中分化轨迹的顶端。APL队列分析确定了白血病干性与白细胞计数升高和FLT3-ITD突变的关联。APL干性评分能够有效预测不良预后和早期死亡。ATRA可诱导细胞往更成熟的状态分化，但在早期死亡的患者表现则不同。
参考文献
Jin W, Dai Y, Chen L, et al. Cellular hierarchy insights reveal leukemic stem-like cells and early death risk in acute promyelocytic leukemia. Nat Commun. 2024 Feb 16;15(1):1423. doi: 10.1038/s41467-024-45737-7. PMID: 38365836; PMCID: PMC10873341.
