图3 对照和患者iPSCs皮质类器官单细胞转录组谱的比较

对患者和对照类器官神经元细胞群的基因表达分析显示，患者中有206个差异表达基因(DEGs)，其中78个上调，128个下调(图4A)。特别是mtDNA编码的几个基因，如MT-ND5、MT-RNR1、MT-RNR2、MTTL1和MT-TY，是最显著下调的基因(图4B)。对下调基因的富集分析强调了与神经元分化、树突形成、铁代谢、活性氧、氨基酸代谢和MAPK信号传导相关的功能(图4C-E)。另一方面，上调基因在神经退行性疾病相关通路、NOTCH和JAK-STAT信号通路中富集(图3F)。

观察由放射状胶质细胞和星形胶质细胞组成的胶质细胞群，发现与对照皮质类器官相比，患者类器官的胶质细胞群中有189个DEGs，83个基因上调，106个基因下调(图4G,H)。GO分析显示，与对照组相比，患者样本中补体激活途径和星形胶质细胞投射等过程富集(图4I,J)。

图4 对照和患者iPSCs皮质类器官分子通路的比较

4、二甲双胍改善POLG皮质类器官的疾病表型

从第6天开始将患者皮质类器官暴露于250 μM二甲双胍中，观察到30天后皮质类器官结构和形态的增强(图5A)。与未处理的样品相比对复合体I NDUFB10、TOMM20和MAP2增加，并且检测到患者皮质类器官TFAM、SOX2和MAP2的免疫染色显著增加(图5A-G)，表明与未治疗的样本相比，二甲双胍治疗增加了mtDNA拷贝数和神经再生。这些结果表明，二甲双胍具有增强POLG类器官表型和增强分子谱的潜力，验证了类器官模型在临床前药物试验中的实用性。

图5 二甲双胍对POLG患者脑类器官神经元损伤及线粒体缺损的修复作用

5、单细胞转录组学证实二甲双胍作用下POLG类器官神经元富集和星形细胞增生减少

接下来，治疗CP2A患者类器官2个月后来评估二甲双胍对POLD类器官的单细胞转录表达谱。经二甲双胍处理的患者皮质类器官细胞类型可进一步细分为多巴胺能神经元、室管膜细胞、成纤维细胞、GABA能神经元、谷氨酰胺能神经元、黑色素细胞、神经祖细胞、放射状胶质细胞、伸长细胞、星形胶质细胞，以及各个细胞的占比情况(图6A-D)。有趣的是，即使在二甲双胍治疗后，也并没有在POLG类器官中检测到DA GLU神经元群，这表明二甲双胍可能不会缓解它的缺失。比较未治疗和治疗的POLG类器官时，二甲双胍治疗似乎减少了星形胶质细胞数量，同时增加了神经元数量。此外，二甲双胍减少了黑素细胞、伸长细胞和成纤维细胞(图6E)。

神经元群体的通路分析显示，下调基因在多个通路中富集，包括与神经退行性疾病和轴突引导相关的通路(图6F)。另一方面，上调基因在与皮质肌动蛋白细胞骨架、皮质细胞骨架、神经元迁移和神经递质转运调节相关的过程中富集(图6G,H)。

图6 二甲双胍治疗前后脑皮质类器官分子通路的比较