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项目文章 | 单细胞核转录组测序揭示E3泛素连接酶保护心肌免受缺血再灌注损伤机制

发布时间：2024-05-07 14:18:13

2024年2月，复旦大学附属中山医院张英梅教授、葛均波院士联合中国科学院分子细胞科学卓越创新中心胡荣贵教授在Cell Discovery上发表“The E3 ubiquitin ligase MARCH2 protects against myocardial ischemia-reperfusion injury through inhibiting pyroptosis via negative regulation of PGAM5/MAVS/NLRP3 axis”的研究成果。该研究发现E3泛素连接酶MARCH2可以通过负调节PGAM5/MAVS/NLRP3信号通路，从而保护心肌免受缺血再灌注损伤的影响。这一发现为未来治疗心血管疾病提供了新的研究思路和方法。

新格元在该研究中承担了单细胞核转录组(GEXSCOPE^®)测序以及生信分析等工作。

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研究背景

心血管疾病是当今社会中最常见的疾病之一，而心肌缺血再灌注(I/R)损伤是心血管疾病的常见病因之一。炎症体激活和细胞焦亡对心肌缺血再灌注损伤的发病机制有一定的贡献，但是这些调节机制尚不完全清楚，因此需要更深入的探究。

技术路线

研究结果

1.心肌I/R期间MARCH2表达的表征

为了研究心肌I/R损伤中可能的泛素化相关分子，作者采用snRNA-seq技术分析了假手术或I/R手术后的WT小鼠心肌细胞。结果显示，六个E3连接酶中MARCH2的转录变化显著。qPCR验证显示，I/R损伤后MARCH2的mRNA水平上升。进一步在人类ICM患者和小鼠I/R损伤后的心肌样本中分析发现MARCH2的蛋白水平也升高。同样，在缺氧和复氧条件下的心肌细胞中，MARCH2表达也增加。这些数据表明，MARCH2在心肌I/R损伤中扮演重要角色。

图1 ICM患者和小鼠在心肌I/R期间MARCH2蛋白水平升高

2.MARCH2缺乏会加剧I/R损伤期间的心功能障碍

为了探究MARCH2在心肌缺血再灌注(I/R)损伤中的作用，研究团队创建了MARCH2基因敲除(KO)小鼠并验证了其基因型。结果显示，KO小鼠的基线心率和收缩压与野生型(WT)小鼠相似。在I/R手术后，KO小鼠的心脏损伤标志物(CK-MB和LDH)水平显著升高，且梗死面积增大。此外，KO小鼠在I/R后心脏功能障碍更为严重，表现为左心室射血分数和分数缩短降低，左心室收缩末期直径和容积增加。对成熟心肌细胞的评估显示，I/R损伤诱发的心肌细胞收缩异常在KO小鼠中加剧。PI染色显示，KO小鼠在I/R后心肌细胞坏死显著增加。这些结果表明，MARCH2的缺失加剧了I/R诱发的心肌功能障碍和心肌细胞死亡。

图2 MARCH2 KO加重心肌I/R损伤后的心肌功能障碍

3.MARCH2缺失诱导心肌I/R后NLRP3炎症小体激活

为探究MARCH2 KO是否加重心脏I/R损伤，作者对WT和MARCH2 KO小鼠进行了snRNA-seq分析。分析显示I/R术后MP和心肌细胞簇发生变化，提示这两类细胞在心脏I/R损伤中起重要作用。WT-I/R组中，NLRP3炎症小体组装相关基因在多种细胞中上调，揭示NLRP3在心肌I/R损伤中的关键作用。KEGG和GO分析强调NOD样受体信号通路、坏死性凋亡及NLRP3炎症小体复合物组装的重要性。相关基因主要在MARCH2 KO心肌细胞中升高，证实心肌细胞的核心作用。GSVA分析显示，MARCH2 KO-I/R心肌细胞中NOD样受体和NLRP3炎症小体复合物组装相关基因显著上调。此外，MARCH2缺失增强NLRP3与ASC的相互作用，表明其可能促进NLRP3炎症小体组装和活化，加剧心脏I/R损伤。

图3 PGAM5与MARCH2相互作用

4.MARCH2通过催化K48连接的多泛素化介导 PGAM5蛋白酶体降解

细胞互作分析显示，MARCH2 KO-I/R心脏中MPs与心肌细胞间相互作用增强。在模拟H/R损伤和促炎环境下，MARCH2促进PGAM5的蛋白酶体依赖性降解。MARCH2的催化活性及其与PGAM5的直接相互作用(通过TM和PDZ结构域)在降低PGAM5水平中起关键作用。MARCH2将K48连接的polyUb链与PGAM5的K88和K141位点偶联，导致PGAM5泛素化和降解。这些发现表明MARCH2在心肌I/R损伤中通过调控PGAM5泛素化降解过程发挥重要作用。

图4 MARCH2 E3连接酶通过K48连接的polyUb促进PGAM5的降解

5.MARCH2抑制心肌I/R后PGAM5依赖性NLRP3炎症小体激活

在ICM患者中，PGAM5与MARCH2蛋白水平呈负相关。MARCH2过表达导致NMCMs中PGAM5蛋白水平下降，而MARCH2缺失降低了PGAM5的K48连接泛素化水平。小鼠心脏I/R损伤后，PGAM5水平上升，MARCH2基因敲除加剧此效应。此外，MARCH2通过影响泛素信号转导调控PGAM5在NLRP3炎症小体中的作用，过表达MARCH2抵消MCM+H/R诱导的ASC升高，削弱PGAM5的共表达效果。

图5 PGAM5介导MARCH2对心肌I/R后NLRP3炎症小体组装的调节

6.在MCM+H/R处理下PGAM5-MAVS共聚体的形成促进了MAVS依赖性NLRP3活化

作者从公共的蛋白质-蛋白质相互作用数据库中发现了PGAM5与MAVS的潜在联系，并通过一系列实验验证该发现。结果表明PGAM5和MAVS能够形成点状结构，并表现出类似液体的特性。此外，还发现PGAM5可以促进MAVS介导的NLRP3炎症小体激活，并在调控NLRP3炎症小体激活过程中的起重要作用。这些发现为理解PGAM5和MAVS如何共同参与NLRP3炎症小体的激活提供了理论基础。

图6 在MCM+H/R攻击下形成的PGAM5–MAVS共聚体，PGAM5促进MAVS依赖性NLRP3活化

7.MARCH2过表达可防止心肌I/R损伤

通过构建病毒载体在心肌细胞中高效表达MARCH2，作者发现与仅使用载体的对照组相比，MARCH2治疗显著提高了小鼠心肌细胞中的MARCH2蛋白水平。这种治疗显著改善了小鼠对I/R损伤的反应，提升了心脏功能，减少了心肌梗死面积，并降低了心脏损伤标志物的水平。MARCH2治疗增加了PGAM5的K48连接泛素化，降低了PGAM5的蛋白水平，增强了线粒体定位的NLRP3和ASC之间的相互作用，并抑制了下游促炎因子IL-18的分泌。这些结果表明MARCH2在心肌I/R损伤治疗中具有巨大潜力。

图7 MARCH2过表达通过抑制PGAM5–MAVS-NLRP3炎症小体通路减少I/R损伤并保留心脏功能

8.心脏PGAM5-MAVS信号转导对于MARCH2对心肌I/R损伤的保护作用至关重要

通过RNA干扰技术敲低心肌细胞中的PGAM5，发现MARCH2的心脏保护作用依赖于PGAM5。MARCH2 KO心脏的负面影响在PGAM5敲低时减轻，梗死面积减小，心脏功能改善。同时，心脏损伤标志物LDH和CK-MB的水平明显降低，caspase-1和GSDMD裂解及IL-18分泌减少。稳定表达MARCH2的AAV9病毒载体显著减小I/R诱导的梗死面积，而PGAM5或MAVS过表达则阻断此效果。MARCH2过表达抵消I/R诱导的损伤标志物升高、心脏功能降低及caspase-1、GSDMD裂解增加，但PGAM5和MAVS共表达时保护作用中止。因此，MARCH2通过抑制NLRP3炎症复合物和焦亡，以PGAM5/MAVS依赖性方式保护心肌免受缺血再灌注损伤。

图8 PGAM5/MAVS信号通路对I/R损伤中MARCH2的调节至关重要

结论

MARCH2表达水平在缺血性人类心脏和遭受I/R损伤的小鼠心脏中升高。MARCH2基因敲除加重了小鼠的心肌梗死和心功能不全。MARCH2负调控 PGAM5/MAVS/NLRP3轴，该轴参与焦亡和炎症小体激活。MARCH2与PGAM5相互作用促进其降解，导致抑制NLRP3炎症小体活化和心肌细胞焦亡。通过基于AAV的转染重新引入MARCH2改善了I/R损伤小鼠的心脏功能。总而言之，MARCH2介导的泛素化负向调控PGAM5/MAVS/NLRP3轴，以保护心肌细胞免受焦亡和心肌缺血再灌注损伤。

参考文献

Y Liu, S., Bi, Y., Han, T. et al. The E3 ubiquitin ligase MARCH2 protects against myocardial ischemia-reperfusion injury through inhibiting pyroptosis via negative regulation of PGAM5/MAVS/NLRP3 axis. Cell Discov 10, 24 (2024). https://doi.org/10.1038/s41421-023-00622-3

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