2024年1月，上海交通大学医学院薛婧课题组在Cell reports上发表“Spatiotemporal role of SETD2-H3K36me3 in murine pancreatic organogenesis ”的研究文章。该研究通过多组学联合分析(scRNA-seq、CUT&Tag、ATAC-seq和bulk RNA-seq), 剖析表观调控分子SETD2在胰腺发育过程中的作用。发现SETD2在Second Transition阶段，维持Tip细胞的干性-增殖平衡，并促进Ngn3+内分泌祖细胞形成。该研究揭示了Setd2调控胰腺器官发育的新功能，并完善了胰腺胚胎发育过程中的表观调控网络。
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研究背景
胰腺是一个兼具内分泌和外分泌功能的消化器官，外分泌功能由腺泡和导管细胞执行，内分泌功能由胰岛执行。胰腺发育的广泛研究在很大程度上是由糖尿病和胰腺癌症等胰腺疾病的转化潜力驱动的。阐明胰腺外分泌发育的分子机制将为再生医学和胰腺疾病的发病机制提供更多的见解。
组蛋白甲基转移酶SET结构域2(SETD2)以H3K36me2为底物，在gene body(GB)区域催化组蛋白H3上赖氨酸的甲基化，参与转录激活和延伸、DNA修复、同源重组和选择性剪接。最近的研究揭示了SETD2/H3K36me3在早期胚胎发育中的重要作用。然而，SETD2-H3K36me3在器官发生中的功能知之甚少。
思维导图
研究结果
1.Setd2的缺失导致小鼠出生时胰腺内外分泌异常
作者用Pdxcre介导在胰腺中特异性敲除Setd2。为验证Setd2缺乏是否影响胰腺的胚胎发育，比较了胰腺特异性缺失Setd2小鼠(PdxcreSetd2f/f)和同窝的对照(Setd2f/f)小鼠刚出生时(P0)的胰腺表型。胰腺形态和大小没有明显差异(图1A,B)。Amylase(腺泡标志物)和Ki67(增殖标志物)的免疫共染色显示，PdxcreSetd2f/f小鼠的胰腺中有更多处于增殖状态的腺泡细胞(图1C)。此外，PdxcreSetd2f/f小鼠的血糖升高(图1D)、β和α细胞数量减少且不能形成成熟的胰岛结构(图1E)。总之，上述数据表明SETD2在胰腺的胚胎发育中起着至关重要的作用，既影响外分泌腺，也影响内分泌腺。
图1. Setd2的缺失导致小鼠出生时胰腺内外分泌异常
2.胰腺器官发生过程中H3K36me3的动态水平和相关转录谱
为探索SETD2在小鼠胰腺发育中的作用，作者检测了H3K36me3在胚胎胰腺上皮细胞中E9.5到P0时期的表达水平。免疫染色显示H3K36me3在E9.5、E11.5和E12.5水平较低，到E13.5开始逐渐增加，并在E15.5达到峰值(图2A)。
接下来，对E11.5至E15.5时期分选的胰腺上皮上细胞进行了RNA-seq、ATAC-seq和CUT&Tag。ATAC-seq结果揭示胰腺发育Second Transition过程(E13.5-E15.5)中染色质可及性的动态变化(图2C)。CUT&Tag测定结果显示H3K36me3信号从E11.5到E15.5逐渐增加，和免疫染色结果一致(图2D)。H3K36me3峰广泛分布在胰腺上皮的全基因组区域(图2E)。为了寻找潜在的SETD2-H3K36me3下游基因，作者整合了RNA-seq中上调的DEG、在启动子区具有ATAC-seq独特峰的基因和在Gene body区域 H3K36me3 信号增加的基因。结果显示：E13.5的H3K36me3相关基因与脂质代谢过程、成纤维细胞生长因子受体信号通路、干细胞增殖的负调控和细胞命运密切相关，而E15.5的H3K36me3相关基因与转录、缺氧反应、细胞质翻译等的正调控相关(图2F,G)。总的来说，H3K36me3水平在胰腺发育Second Transition期升高，H3K36me3下游相关基因参与胰腺发育过程中的多个重要过程。
图2. 胰腺器官发生过程中H3K36me3的动态水平和相关转录组谱
3.scRNA-seq分析揭示了在E13.5和E15.5的Setd2缺陷导致的内外分泌谱系中的异常转录组谱
以单细胞分辨率分析胰腺发育Second Transition期间Setd2-H3K36me3缺失的表现。对E13.5和E15.5时期胰腺特异性缺失Setd2小鼠PdxcreSetd2f/fRosa-EGFP+/−(KO)和同窝对照小鼠Setd2f/fRosa-EGFP+/−(WT)的胰腺上皮细胞进行scRNA-seq(图3A)。经过质控后，对获得的25692个细胞进行后续分析。确定了9个不同的细胞群体(图3A-D)，包括Tip、Trunk、Acinar(腺泡)、EP early(早期内分泌祖细胞)、EP late(晚期内分泌祖细胞)、α、β、ε和δ细胞。Augur分析显示内外分泌谱系中的终末分化细胞在Second Transition阶段均受到Setd2缺失的影响。WT组和KO组之间终末分化细胞中DEG的GO-KEGG分析进一步说明了Setd2缺失时的功能异常。例如，胰腺分泌和蛋白质合成/折叠过程在腺泡细胞中受损(图3F)。
除了异常转录外，还发现WT组和KO组之间的细胞比例存在差异(图3G)。在Setd2缺陷胰腺中，Tip细胞的比例较低，该现象在E15.5尤其显著。鉴于Tip细胞是胰腺谱系分化的第二个分支节点，即可分化形成Acinar,又能形成Trunk，作者比较了E13.5和E15.5的Acinar/Tip和Trunk/Tip的比例(图3H)。两个比率都增加表明Setd2缺陷胰腺中从Tip到Trunk细胞/Acinar细胞的分化过程加快。免疫荧光染色进一步验证了Tip数量的减少。综上，从单细胞水平证实了Setd2缺陷导致胰腺发育在Second Transition时期出现异常。
图3. scRNA-seq揭示Setd2缺陷导致的内外分泌谱系中的异常转录组谱
4.Setd2的缺乏加速了Tip细胞从静止状态向增殖状态的转变
为进一步研究Setd2缺失对外分泌谱系的变化，对Tip和Acinar细胞进行聚类分群，鉴定了7个亚群(图4A-C)。Tip early亚群仅存在于E13.5阶段，高表达干性相关基因。Tip proliferating 1和Tip proliferating 2亚群都高表达细胞周期相关基因。值得注意的是，Tip early 中同时表达增殖促进基因和抑制基因，提示Tip early的增殖状态受到严格调控。
在Setd2缺陷的胰腺中，E13.5时的Tip early亚群细胞比例下降，同时Tip proliferating 1亚群比例增加。UCell分析显示，在Tip early亚群中，Setd2缺陷组的增殖特征评分更高(图4E)。免疫染色证实在E13.5的Setd2缺陷胰腺中存在更多的Ki67+的Tip 细胞(图4F)。同时，scRNA-seq结果中E15.5时观察到更多增殖的腺泡细胞，这可以解释在Setd2缺陷胰腺中观察到的acinar和pro-acinar(腺泡前体细胞)比率增加的原因(图4D)。Tip early亚群中DEG的功能富集分析显示，Setd2缺陷胰腺中上调增殖相关基因，下调氧化磷酸化(OXPHOS)等干性相关基因(图4G)。
接下来，作者试图确定H3K36me3调节Tip的干性-增殖平衡的直接靶点，筛选到一个关键基因Irf6。在Setd2缺失后，Irf6在Tip early亚群中的水平显著降低(图4K–4L)。为了探讨Irf6的缺失是否模拟了由Setd2缺失引起的干性-增殖失衡，作者分离了E13.5的胰腺上皮细胞，并用小干扰RNA(siRNA)沉默Irf6，然后在类器官系统中培养上皮细胞以评估其干性：Irf6敲低后形成更多和更小的类器官，表型和Setd2缺失时类似(图4M)。qPCR分析进一步验证Irf6水平的降低和增殖相关基因(如Pcna)的上调(图4N)。以上数据说明Setd2-H3K36me3通过Irf6控制Tip细胞的静息-增殖状态的转变，Setd2的缺失导致Tip细胞过度增殖，从而分化异常。
图4. Tip细胞中Setd2的缺乏加速了E13.5期从静止状态向增殖状态的转变
5.Setd2-H3K36me3通过Nkx2.2促进内分泌谱系分化
为了进一步了解Setd2缺失胰腺的内分泌谱系发育异常，作者将EP(内分泌祖细胞)与Trunk进行亚群聚类，分为7个亚群(图5A)。Tip-trunk同时表达Tip标记物(Cpa1)和Trunk标记物(Anxa2和Sox9)；Proliferating trunk表达细胞周期相关基因；Trunk-EP表达干细胞维持和Notch信号通路相关的基因，表明其分化潜力(图5B,C)。EP被分为EP1、EP2、EP3和EP4，具有特定的标记基因。考虑到所有EP细胞都来源于Trunk-EP，作者进一步观察到EP1、EP2和EP3与Trunk-EP的比率下降(图5D,E)，这表明Setd2缺失损害了EP的形成。
为了寻找Setd2缺失诱导的内分泌发育缺陷的分子机制，作者比较了所有Trunk、Trunk-EP和EP细胞中的DEG(图5F)。如图5F所示，EP中下调的基因与分化、线粒体丙酮酸盐转运、OXPHOS和细胞增殖有关，而上调的基因与Notch信号通路和胚胎发育有关。值得注意的是，在E13.5和E15.5的Setd2缺陷组中，EP的标志物Neurog3(Ngn3)的mRNA水平显著降低(图5G,H)。同样的，免疫共染色证实在E13.5和E15.5阶段，Setd2缺陷胰腺中的Ngn3+细胞显著减少(图5I,J)。
基于之前的CUT&Tag数据集，Ngn3不受H3K36me3的直接调控。为了寻找负责Ngn3+EP形成的H3K36me3直接靶标，取Setd2缺失时总EP中下调的基因和WT胰腺GB区域中H3K36me3富集的基因的交集，鉴定了四个基因(图5K)，其中，Nkx2.2是一种重要的TF，在转录水平上促进Ngn3表达。综合基因组学查看器(IGV)证实，在E13.5和E15.5，Nkx2.2在GB上的H3K36me3信号增加(图5L)。在Setd2缺失后，scRNA-seq数据显示Nkx2.2转录水平降低，主要体现在E13.5的所有Trunk和EP亚群中(图5M)。此外，通过免疫染色在E13.5和E15.5胚胎胰腺中进一步验证，Setd2缺失的情况下Nkx2.2蛋白水平下调(图5N)。上述结果证实了Setd2在内分泌谱系分配中的重要作用，至少部分通过调节Nkx2.2来确保Ngn3+EP细胞的适当分化。
图5. Setd2-H3K36me3通过Nkx2.2促进内分泌调节
结论
参考文献
Spatiotemporal role of SETD2-H3K36me3 in murine pancreatic organogenesis. Cell reports; IF:8.8; DOI: 10.1016/j.celrep.2024.113703
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