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项目文章 | 单细胞解析晚期胃肠间质瘤伊马替尼耐药的肿瘤免疫微环境

发布时间：2024-05-07 14:45:05

2024年3月，青岛大学附属医院周岩冰、牛兆建教授团队在《Cell Death & Disease》上发表了题为“Deciphering the tumor immune microenvironment of imatinib-resistance in advanced gastrointestinal stromal tumors at single-cell resolution”的研究论文。该研究阐述了晚期GIST中细胞生态系统的异质性和动态特性，揭示了伊马替尼耐药患者的免疫抑制微环境，并探讨了耐药肿瘤与其微环境之间的复杂相互作用。这项研究的发现为加强对伊马替尼耐药性机制的理解提供了宝贵的资源。并且提供了能够逆转这种耐药性的更有效的免疫治疗靶点。

新格元在该研究中提供了SCelLiVe^®组织保存液、SCelLiVe^®组织解离液、GEXSCOPE^®单细胞转录组测序服务。

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研究背景

肿瘤的异质性是解决胃肠道间质瘤(GIST)晚期患者伊马替尼耐药性的一个相当大的障碍。因此，全面了解TME对于理解肿瘤进展和耐药性背后的机制至关重要，重要的是，有助于为晚期GIST选择创新的免疫治疗药物。为了解决这个问题，作者对诊断为局部晚期或晚期GIST的原发性肿瘤以及腹膜和肝转移患者进行了单细胞转录组测序。

技术路线

为了全面了解GIST中的肿瘤生态系统，从7名GIST患者中获得了9例肿瘤手术样本(包括原发性、肝转移性和腹膜转移性)进行单细胞测序，其中3名患者(4例样本)表现出伊马替尼耐药性，4名患者(5例样本)表现出伊马替尼敏感性。此外，为了验证结果，作者招募了另外20名患者，并进行了免疫组织化学(IHC)和多重免疫荧光(mIHC)染色分析。

实验设计流程

研究结果

1.GIST的肿瘤微环境

通过单细胞测序分析共获得了65,576个高质量细胞，这些细胞被注释为各种亚型，包括成纤维细胞、DC(树突状细胞)、T细胞、髓系细胞、NK、SMC(平滑肌细胞)、EC(内皮细胞)和B细胞(图1b)。值得注意的是，所有细胞亚型在每个样本以及两个分组中均有分布，但细胞比例不同(图1b，c)。此外，利用气泡图展示了各亚群的标记基因(图1d)。

图1. GIST的单细胞转录组分析

2.GIST的肿瘤细胞演变分析

为了进一步确认组织中的肿瘤细胞，使用copyKAT算法计算了成纤维细胞和平滑肌细胞的染色体倍性，发现后者具有正常的倍性，因此选择了成纤维细胞进行后续分析。

首先，作者分析了不同样本中的肿瘤进化关系，并在发育树的主干中列出了每个样本的克隆拷贝数变化。其中，最常见的突变包括一个拷贝的7q增加、20p增加和17q丢失，这与先前GIST基因组测序的结果一致。另外，M_L07和P_C07样本分别是同一患者的转移灶和原发灶，文中分析了它们的共同CNV区域。结果表明，M_L07样品中的所有肿瘤细胞都表现出17p拷贝丢失和8p增加的突变，这是由P_C07样品中B亚克隆进化而来的，因此也表明转移灶是在早期通过接种原发性病变形成的。

图2. 肿瘤细胞克隆进化分析

3.肿瘤细胞的转录异质性

首先，对成纤维细胞重新进行了聚类分群，根据每个亚群的基因表达谱信息，作者将肿瘤细胞分为以下6种类型，包括BASP1_fib、DUSP1_fib、IDO1_fib、KITlow DOG+SMA+_fib、PDGFRA_fib和KIT-_fib，这些细胞在所有样品中都可以观察到(图3a,b)。其中，BASP1_fib和DUSP1_fib是成纤维细胞中分布最多的亚群(图3c)。接着，作者分析了上述所有细胞亚群的功能特征(图3d)。正常细胞KIT-_fib富集了一系列免疫相关的通路，包括单核细胞趋化性、髓系白细胞迁移、髓系白细胞活化和白细胞介导的免疫。BASP1_fib高度富集氧化磷酸化及其途径，而DUSP1_fib和IDO1_fib高度富集糖酵解途径，这表明GIST中的肿瘤细胞经历了不同的代谢重编程。此外，在DUSP1_fib和IDO1_fib细胞中高度富集了细胞死亡相关的通路，而在BASP1_fib细胞中则不富集，这说明肿瘤细胞通过不同的代谢通路所具有的功能也存在显著差异。这些结果提示GIST具有较高的肿瘤内异质性。

图3. 六种恶性细胞类型的转录特征和异质性

4.GIST的免疫微环境分析

对每个样本的免疫微环境进行探索，以进一步分析GIST中伊马替尼的耐药机制。首先，作者将T细胞分为以下8种亚型：CD4-CCR7、CD4-GZMK、CD4-FOXP3&MKI67、CD4-FOXP3、CD4-NUPR1、CD8-CCR7、CD8-GZMA&MIK67以及CD8-GNLY(图4a,b)。接着，比较了耐药组和敏感组之间的细胞比例差异(图4c)。令人惊讶的是，耐药组的Treg细胞(CD4-FOXP3)比例远高于敏感组，这意味着Treg细胞可能参与了伊马替尼耐药性。此外，在耐药组中，增殖状态的Treg细胞(CD4-FOXP3&MKI67)的比例也显著增加，而细胞毒性CD8 T细胞的数量呈下降趋势。上述结果进一步说明了Treg细胞与伊马替尼耐药性之间的相关性。

基因表达分析结果表明，TIGIT在Treg细胞和增殖的Treg细胞中高度特异性表达，并且TIGIT在耐药组和敏感组的Treg细胞中表现出明显差异表达(图4d，e)，该基因是一种参与肿瘤免疫逃逸的免疫检查点基因。通过实验验证后，确定了Treg细胞中标记基因FOXP3的表达显著增加(P<0.05)。作者还通过多色免疫荧光法分析了FOXP3和TIGIT的共表达，并观察到这两个基因在同一细胞中表达(图4f)。

接下来，使用Monocle2进行轨迹推断，分析CD4+ T细胞的免疫状态动态转变和细胞分化关系。结果显示CD4-ccr7细胞处于轨迹路径的起点，称为状态3；轨迹的一个分支末端是CD4-FOXP3和CD4-FOXP3&MKI67细胞，称为状态2，该分支末端细胞具有耗竭特征；另一个分支末端是CD4-NUPR1细胞，称为状态1，该分支末端细胞具有细胞死亡特征(图4g-j)。然后，分析了不同患者的CD4+ T细胞轨迹图。作者发现在状态2中富集的细胞大多来自耐药组(图4k)，与Treg细胞和增殖的Treg细胞的高富集一致。这表明naïve T细胞在耐药组中更有可能分化为抑制性Treg细胞，并最终发生凋亡。

图4. T细胞内部的异质性

5.髓系细胞的异质性

接着，作者又分析了髓系细胞，并将其分为4个亚群，包括TAM、IDO1_DC、CD1C_DC和LAMP3_DC，它们都高度表达其标记基因LYZ(图5a，b)。值得注意的是，耐药组中IDO1_DC的比例显著增加，可能与伊马替尼耐药有关(图5c)。作者进行了多色免疫荧光(mIHC)来检测TME中IDO1_DC的分布情况，发现IDO1_DC在伊马替尼耐药TME中的分布远多于在敏感TME中(图5d)。

图5. 髓系细胞内的异质性

6.GIST肿瘤微环境中的细胞间通讯

通过分析细胞间通讯来探讨GIST中伊马替尼耐药性的分子机制。作者研究了耐药组和敏感组间不同肿瘤细胞亚群的通讯差异。结果显示，在耐药组中存在PDGFRA_fib、BASP1_fib、DUSP1_fib和IDO1_fib四个亚群，它们通过TIGIT-NECTIN2与Treg细胞和增殖Treg细胞进行细胞间通讯；而在敏感组中，只有BASP1_fib和IDO1_fib与Treg存在弱通讯。此外，在耐药组中，IDO1_DC和髓系细胞之间通过BTLA-TNFRSF14发生细胞间通讯，这在敏感组中并不显著(图6a)。在耐药组中，NECTIN2在肿瘤细胞和LAMP3_DC中高表达(图6b)；BTLA在IDO1_DC中高度表达(图6c)；TNFRSF14在髓系细胞和肿瘤细胞中高度表达，尤其是在伊马替尼耐药患者中(图6d)。上述基因对的表达表明免疫检查点通路的激活参与了伊马替尼耐药。临床样本的免疫组化分析也证实了这些患者免疫检查点蛋白的表达增加(图6e)。

图6. 伊马替尼耐药的综合免疫抑制机制

结论

研究结果表明，在伊马替尼耐药的TME中，具有激活免疫和细胞因子介导的免疫应答的肿瘤细胞通过TIGIT-NECTIN2轴与更高比例的Treg细胞相互作用。未来针对Treg的免疫治疗策略可能为伊马替尼耐药患者的治疗提供新的方向。此外，IDO1+ DC细胞在伊马替尼耐药TME中高度富集，通过BTLA-TNFRSF14轴与多种髓系细胞相互作用，而在伊马替尼敏感TME中相互作用不显著。该研究强调了晚期GIST的转录异质性和独特的免疫抑制微环境，为伊马替尼耐药性提供了新的治疗策略和创新的免疫治疗剂。

参考文献

[1] Liu X, Yu J, Li Y, et al. Deciphering the tumor immune microenvironment of imatinib-resistance in advanced gastrointestinal stromal tumors at single-cell resolution. Cell Death Dis. 2024 Mar 5;15(3):190. doi: 10.1038/s41419-024-06571-3. PMID: 38443340; PMCID: PMC10914684.