1.活动性JDM患者外周独特的CD8+ T细胞比例和升高的I型IFN反应

为了更准确地描述JDM患者的免疫状态，研究者分析了3个临床队列中JDM患者CD8+T细胞状态。在年龄和性别匹配的初发JDM和稳定JDM患者队列、活动期JDM与稳定期JDM患者队列以及治疗前后JDM患者队列中均发现CD8+ T细胞/淋巴细胞比值变化，尤其是在初发/活动期/治疗前JDM患者中该比值均显著降低。

为了进一步研究活动期JDM患者的CD8+T细胞特征是否为JDM疾病所独有，选取了儿童系统性红斑狼疮(SLE)患者和JDM患者进行比较，发现新发JDM患者的CD8+ T细胞/淋巴细胞比值和CD8+ TCM/ T细胞比值显著降低。

ISG表达水平可以代表IFN应答情况，通过ISG计算的IFN评分是多种自身免疫性疾病的重要疾病生物标志物。与稳定期患者相比，活动期JDM患者的PBMC中IFI27、IFI44L、RSAD2表达水平显著升高，全血中IFI44L和RSAD2表达水平也显著升高。活动期JDM患者PBMC和全血的IFN评分均显著升高。基于此结果研究者发现活动性JDM患者免疫细胞广泛受I型IFN的影响。

CD8+ T细胞特征可能是活动性JDM患者的一种重要免疫现象。根据平均CD8+ T细胞比例将所有新发活动期JDM患者分为高CD8+ T细胞和低CD8+ T细胞比例组，比较两组临床特征。两组在抗体、皮疹、钙化或多系统受累方面无差异，但在肌肉损伤方面有显著性差异。在CD8+ T细胞水平较低的活动期JDM组中，24.1%的患者出现肌肉损伤，高于CD8+ T细胞水平较高的活动期JDM组。这些结果表明外周循环CD8+ T细胞减少的特点可能与肌肉损伤表型有关。

2.JDM患者肌肉活检表现为CD8+ T细胞浸润、高MHC-I和高I型IFN信号

骨骼肌细胞损伤、肌间血管炎、免疫细胞浸润是皮肌炎患者肌肉病理的典型特征。组织学染色结果显示与健康人相比，活动期JDM患者的肌肉活检具有典型的DM特征，肌纤维也存在异常。与健康骨骼肌相比，JDM骨骼肌中几个严重受损区域CD8+ T细胞浸润增加，肌周膜和肌肉MHC-I阳性过表达。研究者还在肌间结缔组织中发现了许多CD27阳性淋巴细胞，提示JDM患者肌间结缔组织中浸润的淋巴细胞活化。JDM患者的肌细胞核还显示高IFIT1信号，代表增加的I型IFN反应。在JDM患者的肌肉中，CD8+ T细胞分别和IFIT1、ISG15共染色，提示在JDM患者中I型IFN信号通路影响肌肉浸润的CD8+ T细胞。

图2 活动期JDM患者的骨骼肌病理

 

3.单细胞转录组测序揭示I型IFN是活动期JDM患者CD8+ T细胞分化改变的驱动因素

取6例活动性JDM患者、3例稳定期JDM患者和3例年龄匹配的健康儿童PBMC进行单细胞RNA测序，细胞聚类注释得到10种不同细胞类型：T细胞、B细胞、NK细胞、中性粒细胞、中性粒祖细胞、嗜碱性粒细胞、增殖细胞、浆细胞、pDC和单核细胞。组间差异分析发现与稳定期JDM患者和对照组相比，活动期JDM患者的T细胞倾向于表现出I型IFN反应的升高。

将T细胞细分注释得到7种细胞类型：CD8+ naive T细胞、CD4+ naive T细胞、CD8+ Teff细胞、GDT细胞、Treg细胞和ILC3细胞。与流式结果一致，活动期JDM患者的CD8+ naive T细胞比例高于其他组。然后研究者进一步对CD8+ T细胞进行了无监督聚类，得到3个CD8+ naive T亚群和4个CD8+ Teff亚群。与稳定的JDM患者和对照相比，活动期JDM患者CD8+ naive T_2和CD8+ Teff_4亚群比例较高。这两个亚群的差异基因，如IFI44L、ISG15、RSAD2、IFIT3、MX1和IFI6，属于I型IFN下游的ISG。因此研究者假设I型IFN与活动期JDM患者CD8+ T细胞的异常分化有关。

对7个CD8+ T细胞簇的Cytotrace评分，分析CD8+ naive T_2具有最显著的分化潜能，以这一簇为起点，对所有CD8+ T细胞进行了monocle分析，其中CD8+ Teff Cluster 4分布在拟时间轴的末端。通过GeneSwitches分析，研究了从起源到state1的驱动基因。在CD8+ naive T细胞的发育过程中，部分基因如IFIT1、RSAD2、IFI44L的表达随着发育逐渐降低，这些基因是典型的I型IFN刺激基因。通路富集分析显示，下调通路主要富集在感染和I型干扰素相关通路。类似地，state6也进行了GeneSwitches分析。结果显示，CD8+ Teff细胞需要上调ISG15、IFI6、MX1和IFI44L等基因才能进入state6。这些结果提示I型IFN是活动性JDM患者CD8+ T细胞异常分化的驱动因素。

图3 单细胞转录组测序显示JDM患者CD8+ T细胞特征

4.I型IFN干扰CD8+ T细胞分化并增强其细胞毒性作用

CD8+ T细胞的细胞毒功能分为直接途径和间接途径，其中直接途径涉及颗粒酶释放以裂解靶细胞。单细胞测序结果显示活动期JDM患者CD8+ T细胞表达较高水平的GZMA和GZMB。细胞实验发现活动期JDM患者的CD8+ T细胞引起更多的靶细胞凋亡；IFNa诱导CD8+ T细胞的迁移和趋化作用更强，凋亡更快，可增强CD8+ T细胞的杀伤能力，进一步导致更多靶细胞死亡；IFNa诱导CD8+ T细胞Ifit1基因表达水平升高，Gzma和Gzmb表达水平也升高，这些结果证实IFNa可以增加CD8+ T细胞的细胞毒性，促进靶细胞的凋亡。

然后，研究者建立了STING激动剂诱导的小鼠模型来验证I型IFN对CD8+ T细胞分化的影响。与对照组相比，STING组血液中Isg15基因表达水平更高，在脾脏中显示出较高的CD8+ naive T细胞比率、较高的活化CD8+ T细胞比率和较低的记忆CD8+ T细胞比率。这些体内外实验均证明I型IFN可干扰CD8+ T细胞的分化和细胞毒性作用。

图4  I型IFN可干扰CD8+ T细胞的分化和细胞毒性作用

 

5. EAM小鼠模型外周I型IFN反应增强，骨骼肌CD8+ T细胞浸润增加

EAM模型模拟了DM和多发性肌炎(PM)的组织病理学。小鼠EAM造模后，EAM组血液中Isg15基因表达水平和肌炎病理评分高于假手术组。HE染色结果显示EAM组肌细胞损伤，肌间炎性细胞浸润。在基础状态和造模后第14天，两组最大上肢抓地力无显著差异；在建模后第21天和第26天，EAM组的平均最大上肢抓地力显著低于假手术组，表明EAM组存在肌肉损伤。EAM组显示出较高的白细胞和中性粒细胞水平，这表明了全身炎症状态。肌炎的标志之一是肌间血管炎，血管炎表现为血液的高凝状态。EAM组的血小板计数水平高于sham组，提示EAM组发生了血管炎。EAM小鼠肌肉病理与人类活检病理相似，EAM组的腓肠肌中有CD8+T细胞浸润，并显示出强烈的MHC-1信号。EAM小鼠骨骼肌中CD8+T细胞与IFIT1共染色，EAM组腓肠肌MHC-1蛋白表达高于Sham组，这一发现表明异常的CD8+ T细胞和骨骼肌中MHC-1的高表达可能是肌炎表型的原因。

图5 EAM模型的评估和组织病理学