随着人类生物学研究的不断深入，对新的生物模型的需求也不断增加。虽然传统的研究模型已被广泛应用，但难以准确反映组织、器官在机体中的生理现象。类器官(Organoid) 是来源于干细胞或器官祖细胞的三维细胞聚集体, 可分化和自组织形成具有人体相应器官的部分特定功能和结构。由于类器官具有人源性，可模拟器官发育和形成，在体外长期扩增中具有基因组稳定性，并能够形成活体生物库进行高通量筛选等优势，成为近年来备受关注的体外模型。然而，在我国肾脏病领域，却一直缺乏肾脏相关类器官研究，这使得无法完全揭示肾脏分化发育、肾病发生的机制。
2024年，中国工程院院士刘志红教授及其团队在Advanced Science(Weinh)上发表了中国肾脏病领域首篇关于类器官的研究，该研究揭示了肾母细胞瘤-1（WT1）与足细胞发育之间的关键调控路径，并明确了WT1突变的致病作用。更为重要的是，该项研究提示肾脏类器官可以作为肾病基础研究的重要手段。
新格元在该研究中提供了SCelLiVe®组织保存液和组织解离液。
研究思路
用胎儿的肾脏样本，确立肾脏发育关键时间点WT1调控靶基因的变化数据。这些数据会与肾脏类器官进行对照，确定其与胎儿肾脏具有很高相似性。之后，采用WT1基因敲除的诱导性多能干细胞以及WT1突变患者的诱导性多能干细胞进行体外培养，观察肾脏类器官的发育情况，最后尝试使用基因编辑修复WT1突变，进一步观察肾脏类器官的发育情况。
主要研究结果
1. 绘制胎儿肾脏发育中WT1转录调控图谱
研究人员利用既往研究scATAC-seq的数据，分析了在妊娠13、16、17和18周时的6个人类胎儿肾脏样本，联合同样时间点的胎儿肾脏scRNA-seq数据，进行了相关图谱聚类分析。基本形成了人类胎儿时期肾脏发育的基础模型。
图1. 胎儿肾脏发育过程中WT1结合的动态变化
2.在肾脏类器官主要细胞分化轨迹中确定胎儿肾脏发育WT1相关表观基因组景观
基于scATAC-seq和scRNA-seq研究的数据，加深对肾脏发育的认识，在体外培养出与胎儿肾脏发育相似的肾脏类器官。体外培养的肾脏类器官相关图谱聚类分析；NPC、SSBPod和足细胞簇的WT1染色质开放及表达情况；WT1结合位点的总体分布以及WT1靶基因（关键信号通路分子）特异性表达的细胞类型均与胎儿肾脏发育模型无显著差异。
图2. 肾类器官发育过程中WT1结合的动态变化
3.WT1突变诱导培养肾脏类器官足细胞发育迟缓的机制
研究人员通过scRNA-seq分析肾脏类器官的细胞组成，之后选取了SSBPod及足细胞簇进行分析。拟时序结果显示，足细胞簇的分化时间点滞后于SSBPod簇。而且，SSBPod细胞在患者样本中占很大比例，而足细胞在对照样本中占很大比例，提示患者的足细胞发育延迟。GO分析导致足细胞发育迟缓的关键信号通路。进一步分析以上信号通路的关键基因发现，在患者样本中，足细胞发育标志物OLFM3的表达增加，而裂孔隔膜(NPHS1, NPHS2, CD2AP)、WNT信号通路(PLCE1, MAGI2)和细胞骨架 (MYH9)的基因表达均降低。
图3. scRNA-seq揭示了来自患者培养的肾类器官足细胞的基因表达谱缺陷
4.移植肾类器官足细胞中WT1突变导致的细胞过程失调
作者利用scRNA-seq分析植入后肾脏类器官，进一步阐明WT1突变导致的相关分子变化。结果发现，随着类器官成熟，对照组和患者组的SSBPod簇细胞数量均大幅减少，因此难以单独聚类出SSBPod簇，但是，与对照相比，患者足细胞中的OLFM3表达依然显著增加，这同样提示患者来源类器官的足细胞发育延迟。GO分析证实了WT1突变在足细胞发育和结构通路中的关键作用，该结果与体外培养阶段的分析非常相似。在患者样本中，足细胞发育标志物OLFM3的表达增加，而血管化通路(ANGPTI)、裂孔隔膜(NPHS1、CD2AP)、WNT信号通路(PLCE1、MAG12、SULF1)、细胞骨架(MYH9)和细胞黏附(ITGA3、COL4A3、COL4A4)标志物的表达均降低。总体而言，在植入后肾脏类器官阶段，患者足细胞同样发育迟缓，足细胞结构存在缺陷，最终导致肾小球滤过屏障受损。
图4. scRNA-seq分析表明，来自患者移植肾类器官的足细胞的三个亚群存在基因表达谱缺陷
结论
该研究证明WT1作为调节足细胞发育的关键转录因子，在肾脏发育和肾脏类器官分化过程中维持了足细胞的结构和功能。
参考文献
Wang G, Wu H, Zhai X, et al. Kidney Organoid Modeling of WT1 Mutations Reveals Key Regulatory Paths Underlying Podocyte Development. Adv Sci (Weinh). 2024 May 29:e2308556. doi: 10.1002/advs.202308556. Epub ahead of print. PMID: 38810140.
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