单细胞研究结果

图1 RBPJ调节单核细胞来源的巨噬细胞分化

2.RBPJ调节MASH中巨噬细胞亚群的发育轨迹和空间生态位

通过流式进一步验证了RPBJ缺失后单核和巨噬群体的变化。发现MoKCs、Clec4e⁺巨噬细胞和C1qc⁺巨噬细胞相对数量没有变化。然而，Clec4e⁺巨噬细胞、Spp1⁺巨噬细胞和MoKCs的绝对数据量明显降低，其中C1qc⁺巨噬细胞受影响最小(图2A-C)。单细胞轨迹推断发现Ly6C^hi单核细胞转化为C1qc⁺巨噬细胞，Spp1⁺巨噬细胞和MoKCs细胞。RBPJ缺失后显示Clec4e⁺巨噬细胞代表中间亚群和Ly6Clo单核细胞分支(图2D)。利用小鼠模型研究Ly6C^hi单核细胞募集的动力学发现随着时间变化Ly6C^hi分化为MDMs，并且这些细胞逐渐表达MHCⅡ和Tim4，Ly6C表达缺失(图2E,F)。Clec4e⁺巨噬细胞在较早的时间点在总Tomato+巨噬细胞中占主要比例，而C1qc⁺和Spp1⁺巨噬细胞在第1周时占同等比例。MoKCs在他莫昔芬治疗后2周成为优势，在4周时占90%以上(图2G)，表明它们的半衰期比其他亚群更长。然而，随着时间的推移，所有亚群的绝对数量迅速下降(图2H)。这表明在MCDD诱导的MASH中，MoKCs不能自我维持超过8周。

进一步分析了GSEA，发现与其他两个MDM亚群相比，Clec4e⁺巨噬细胞中的凋亡信号通路明显上调，其中包括死亡受体基因Fas的上调表达(图2I)。流式细胞术证实了这一结果，与WT肝脏中存在的其他单核细胞和巨噬细胞亚群相比，Clec4e⁺巨噬细胞中Fas (CD95)的表达明显高(图2J,K)。综上，在MASH中，募集的Ly6C^hi单核细胞迅速分化为寿命较短的Clec4e⁺巨噬细胞，并在第一周内凋亡死亡，其中小部分分化为C1qc⁺巨噬细胞和Spp1⁺巨噬细胞。然后MoKCs出现，逐渐成为优势种群，并与CV一起定位。

图2 RBPJ调节MASH中Mac亚群的发育轨迹

3.RBPJ信号控制着MASH中巨噬细胞亚群的转录组学和功能景观

脂质代谢紊乱、炎症和纤维化都导致MASH的进展。首先，检测了MASH WT与Lyz2^CreRbpj^fl/fl肝脏中细胞因子和趋化因子的含量。Lyz2^CreRbpj^fl/fl MASH组促炎因子CCL2和肿瘤坏死因子α(TNF-a)显著降低(图3A)。对scRNA-seq数据进行GO分析显示，Clec4e⁺巨噬细胞中富集程度最高的通路与炎症反应、细胞趋化性和凋亡信号通路有关代表促炎巨噬细胞亚群(图3B)。另外Clec4e⁺巨噬细胞分泌的白细胞介素-1b(IL-1b)和TNF-a更高(图3D)。GO分析显示C1qc⁺巨噬细胞高表达MHC蛋白复合物和抗原加工递呈通路相关基因，而Spp1⁺巨噬细胞上调结合整合素、脂肪酸、脂蛋白颗粒相关通路相关基因。此外，单细胞数据显示，与WT小鼠相比，Lyz2^CreRbpj^fl/fl中所有亚群的Ccl2表达显著降低(图3F)，这与Ly6Chi单核细胞募集缺陷和CCL2细胞因子产生减少(图3A)一致。总之，在缺乏Notch信号的情况下，Ly6C^hi单核细胞募集减少，单核细胞向巨噬细胞转化减弱可能共同促进了MASH中促炎细胞因子的表达降低。

虽然MCDD诱导后非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)活性评分比较相似，但小鼠血清中肝纤维化减少(图3H)。还观察到肝脏脂肪变性、小叶炎症和纤维化无显著缓解(图3I,J)。最后，将小鼠数据与人类肝脏的scRNA-seq数据集(瘦与肥胖)进行了整合在人肝脏中发现了转录组相似的Ly6C^hi和Ly6C^lo单核细胞、Cle4e⁺、C1qc⁺、Spp1⁺巨噬细胞、MoKCs和ResKCs群体(图3K,L)。同样，人CLEC4E⁺巨噬细胞表达最高的促炎基因(图3M)。结果表明，在大多数MASH小鼠模型和人的肝脏中可以鉴定出相似的单核细胞和巨噬细胞亚群，表现出高度保守的细胞功能和代谢特征。

图3 RBPJ信号控制MASH中巨噬细胞亚群的转录组学和功能景观

本文整合了scRNA-seq、谱系追踪和小鼠模型，揭示了Notch-RBPJ信号控制巨噬细胞的发育，影响炎症和疾病的严重程度，抑制RBPJ可降低MASH的严重程度。为MASH的治疗提供了思路。

Guo W, Li Z, Anagnostopoulos G, et al,. Notch signaling regulates macrophage-mediated inflammation in metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease. Immunity. 2024 Sep 19:S1074-7613(24)00414-X. doi: 10.1016/j.immuni.2024.08.016.