项目文章三连拍 | BET溴结构域蛋白抑制剂JQ1调节精子细胞发育
发布时间：2021-03-18 10:25:45
1月9日，南通大学生殖医学研究院孙斐教授及其团队联合新格元生物科技有限公司，在《Genes & Diseases》期刊发表了一篇利用scRNA-seq和ATAC-seq技术研究BET溴结构域蛋白抑制剂JQ1对小鼠精子发育过程影响的文章，题为：BET bromodomain inhibitor JQ1 regulates spermatid development by changing chromatin conformation in mouse spermatogenesis.
研究背景
哺乳动物的溴结构域和外部末端结构域(BET)家族由BRD2、BRD3、BRD4和BRDT组成。这四种蛋白都参与精子发生，BRDT仅在睾丸中表达。作为一种BET溴结构域抑制剂，JQ1已被证明对多种不同的癌症有效。在生殖方面，JQ1可作为一种新型避孕药用于雄性小鼠，因为JQ1可导致雄性小鼠生殖细胞缺陷和精子活力下降，且这种作用是可逆的。然而，JQ1作用于精子发生的具体机制以及药物治疗后的副作用尚不清楚。因此研究JQ1抑制剂对精子发育过程中细胞类型动态变化，以及对生殖细胞的染色质构象的影响，探究精子发生和精子成熟的调控机制，可为生殖健康和研究有效的男性避孕措施提供重要的参考依据。
研究方法
作者对JQ1处理小鼠（JQ1）、载体对照处理小鼠（Control）和野生型小鼠（WT）进行单细胞测序(scRNA-seq)，研究JQ1在精子发生中的转录调控功能。进一步利用ATAC-seq研究JQ1对粗线期精母细胞（pacSC）和圆形精细胞染色质的开放状态的影响。
研究结果
1、JQ1处理引起小鼠雄性生殖细胞缺陷
为评价JQ1对生精的抑制作用，将3周龄幼年C57BL/6雄性小鼠腹腔注射JQ1溶剂，与对照组（Control）和WT小鼠相比，JQ1处理的小鼠睾丸体积和重量显著减小，且JQ1处理后圆形精子细胞和生殖细胞数量减少，一些异常精子细胞的细胞核较大，细胞质和共生体丰富。表明BET溴结构域抑制剂JQ1可以引起生殖细胞缺陷。
图1 JQ1处理抑制睾丸生长并触发生殖细胞缺陷
2、JQ1处理的小鼠睾丸单细胞转录组图谱及细胞类型鉴定
为了研究JQ1处理后特定细胞类型的基因表达变化，对WT、对照和JQ1处理小鼠的睾丸组织进行scRNA-seq，分别获得了2776、2936和2291个细胞，共注释出19个生殖细胞簇，以及3个体细胞簇。包括分化的精原细胞(Diff. SG)，不同阶段的精母细胞，8个连续阶段的圆形精子细胞，4个连续阶段的伸长精子细胞，间质细胞，巨噬细胞和支持细胞。
图2 单细胞转录组图谱和细胞类型鉴定
3、JQ1处理的小鼠睾丸基因表达特征
与Control相比，JQ1处理组体细胞和精母细胞的数量显著增加，尤其是间质细胞、巨噬细胞、SC-3、SC-5和SC-6，精子细胞数量显著降低，尤其是ES-3和ES-4。结果表明，JQ1可以增加体细胞和精母细胞的数量，减少精子细胞的数量。
进一步研究每种细胞类型的基因表达变化，与Control相比，JQ1处理组的DEG表达下调主要涉及SC-6、RS-3、RS-4、RS-5、RS-6、RS-7和Leydig细胞。进一步研究JQ1对精子发生中特定功能通路的影响，发现“精子细胞发育”、“精子细胞分化”、“鞭毛精子活力”、“精子活力”四个生物学过程，与精子发生和精子成熟密切相关。
图3 WT、Control和JQ1处理小鼠睾丸的独特基因表达特征
4、JQ1处理的小鼠睾丸DNA构象的变化
为了进一步研究JQ1对小鼠睾丸特定功能通路的影响，对Control组和JQ1处理组的剩余细胞群的DEG进行GO富集分析。JQ1处理组中表达下调的DEG，主要与“细胞核组织”、“DNA包装”和“DNA构象改变”功能显著相关。
为了验证JQ1对DNA构象的调控作用，检测与DNA构象变化相关的基因在睾丸细胞中的RNA表达水平。q-PCR结果显示，经JQ1处理后，PRM1、PrM2、Prm3、Tnp1、Tnp2和Hils1 基因的转录水平显著降低。为了探讨这种现象是否也存在于特定的生殖细胞类型，从WT，Control组和JQ1处理组的小鼠分离和纯化了pacSC和RS，并通过形态学特征和q-PCR验证，结果显示，与DNA构象变化相关的基因的差异表达更为显著，尤其是在RS中。这些现象表明，JQ1处理可能通过改变染色质构象而影响基因表达，进而导致生殖细胞缺陷。
图4 JQ1处理的小鼠睾丸DNA构象的变化
5、JQ1处理的小鼠睾丸染色质可及性的变化
染色质的开放状态是染色质构象的一种。为了进一步研究JQ1处理对染色质构象变化的影响，利用ATAC-seq检测pacSC和RS细胞的染色质可及性。结果发现，随着生殖细胞的发育，转录起始位点(TSS)和转录延伸位点(TES)附近染色质可及性逐渐降低，对照组高于JQ1组，WT组最弱。Motif分析表明，Control和JQ1处理组染色质开放区域富含相同的TF序列，如NFY、KLF1、Sp2、Sp1和SP5。
减数分裂重组是由DNA双链断裂(DSB)的引入引发的，通过比较减数分裂DSB位点数目，发现JQ1处理的pacSC的DSB位点数目低于Control组pacSC，而JQ1处理的RS的DSB位点数目略高于Control组RS。这些结果表明，JQ1处理可能通过调节减数分裂重组而影响精子发生。对Control和JQ1处理组染色质开放区差异基因的GO功能分析，发现主要与“DNA修复”、“共价染色质修饰”、“细胞器分裂”、“组蛋白修饰功能相关”，KEGG功能分析表明主要与“内质网蛋白加工”、“亨廷顿病”和“帕金森病”功能相关。
进一步研究与16号染色体DNA构象变化相关的四个基因(prm1、prm2、prm3和Tnp2)的可及性，发现JQ1处理后这些基因的可及性降低。结果表明，JQ1处理可能通过降低PacSC和RS的染色质可及性来调节基因表达。
图5 JQ1处理的小鼠睾丸染色质可及性的变化
研究结论
本研究对WT、Control和JQ1处理的小鼠睾丸进行scRNA-seq，发现JQ1处理可以增加体细胞和精母细胞的数量，减少精子细胞的数量；且JQ1处理后下调发育早期生殖细胞的DNA构象变化和精子细胞发育生物学过程。ATAC-seq数据进一步证实JQ1处理可以改变染色质的开放状态；此外，JQ1还可以改变pacSC和RS中的减数分裂DSB位点的数量和转录因子序列类型。多组学分析表明，JQ1通过改变小鼠精子发生过程中染色质构象来调节基因转录的能力，将增强JQ1在男性避孕药中的有效性，对生殖健康的研究具有重要的参考价值。
参考文献
Wang X R, Sang M M, Gong S N, et al. BET bromodomain inhibitor JQ1 regulates spermatid development by changing chromatin conformation in mouse spermatogenesis. Genes & Diseases. 2021 Jan 09. doi.org/10.1016/j.gendis.2020.12.012.
