2024年5月，清华大学基础医学院彭敏团队在Nature Immunology发表一篇题为“A single infusion of engineered long-lived and multifunctional T cells confers durable remission of asthma in mice”的文章，本研究利用IL-5作为靶向结构域，设计并开发了可根除的长寿命嵌合抗原受体(CAR-T)细胞——5TIF4细胞，单次注射能够持久抑制肺部炎症并减轻哮喘症状，并且能维持至少一年，期间还能持续防止过敏性免疫反应。该CAR-T细胞或为长期缓解过敏性哮喘提出了一种潜在疗法。
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研究背景
哮喘是最普遍的呼吸系统疾病，影响着全球超过3亿人，每年造成约25万人死亡。哮喘缺乏一种可以通过单次给药给予长期缓解的疗法。大约一半的哮喘患者表现出高2型表征，其特征是由2型细胞因子(IL-4、IL-5和IL-13)驱动的IgE产生、嗜酸性粒细胞增多、粘液分泌过多和支气管高反应性。靶向IL-4/IL-5/IL-13的生物制剂已被批准用于治疗严重哮喘。然而，这些生物制剂需要终生给药，并且不具有治愈性或成本效益。
思维导图
研究结果
1. 5TIF细胞的设计思路
彭敏教授团队在先前的研究中发现对免疫功能正常的小鼠进行单次输注CAR19TIF[敲除BCOR和 ZC3H12A的CD19 CAR T细胞，称为永生样功能性T(d immortal-like and functional T，TIF)细胞]，会导致CD19 B细胞永久耗竭[2]。这一成功先例使其团队开始研究是否可以通过CAR T细胞实现长期嗜酸性粒细胞耗竭。
随后，该团队设计了一种以小鼠IL-5(mIL-5)为抗原结合部分的CAR，它可与小鼠和人类IL-5Rα14结合(图 1a)。表达IL-5 CAR的T细胞(以下称为5T细胞)预计会消除IL-5Rα+细胞，主要是嗜酸性粒细胞(图1a)。受 CAR19TIF的启发，作者团队尝试通过TIF程序增强5T扩增。他们通过基因编辑，发现单独敲除Bcor或Zc3h12a不会促进5T扩增或杀死嗜酸性粒细胞，而敲除Bcor和Zc3h12a会使5T大幅扩增，称为5TIF，从而耗尽嗜酸性粒细胞(图1g,h)。5TIF在体内持续存在至少1年(此处1年仅指该实验的结束时间；图1i)，维持嗜酸性粒细胞耗竭(图1j)。
图1. IL-5 CAR T 细胞中 BCOR 和 ZC3H12A 的敲除会产生5TIF
2. 5TIF细胞的特征以及对免疫系统的影响
对小鼠移植5TIF一个月后，来自脾脏的5TIF细胞表现出中枢记忆样CD44hiCD62Lhi表型(图2a-d)，同时也表达PD-1、TCF1和EOMES(图2e,f)，这是CAR19TIF细胞的特征。RNA-seq分析显示，5TIF细胞表现出效应T细胞和前体耗竭T细胞(TPEX)的混合特征，但与记忆T细胞不同(图2g)，与CAR19TIF细胞的特征一致。
图2. 5TIF细胞表型
3. 5TIF4细胞的设计与特征
除了IL-5引起的嗜酸性粒细胞增多症外，IL-4和IL-13在2型高哮喘中也发挥着关键作用。作者团队设计了5TIF细胞以稳定表达小鼠版本的IL-4突变蛋白 (Gln116Asp/Tyr119Asp)，该突变蛋白可阻断IL-4/IL-13 信号传导(图3a)，命名为5TIF4。ELISA证实5TIF4分泌了IL-4突变蛋白(图3b,c)。作者检查了5TIF和5TIF4对2型炎症的影响。用PBS、5TIF或5TIF4转移的小鼠在明矾存在下用OVA蛋白免疫以诱导2型反应(图3d)。5TIF小鼠的血清IL-5水平略有降低，但IL-13水平没有降低(图3e,f)，可能是由于嗜酸性粒细胞产生IL-。相反，5TIF4小鼠的IL-5和IL-13均显着降低(图3e,f)，表明IL-4突变蛋白在抑制IL-5和IL-13产生方面起着关键作用。始终如一的是，5TIF4小鼠的浆细胞减少，而5TIF小鼠的浆细胞没有减少(图3g,h)。因此，5TIF4小鼠的总IgE水平以及OVA特异性IgE和IgG1降低，而5TIF小鼠的IgE和IgG1降低(图3i-k)。这些数据表明，5TIF4细胞在抑制2型炎症方面比5TIF细胞更有效。
图3.5TIF4分泌 IL-4 突变蛋白的细胞可减轻体内 2 型炎症
4. 5TIF4细胞可长效缓解2型哮喘
然后，作者评估了5TIF和5TIF4对哮喘的疗效。在所有模型中，小鼠均接受单次静脉输注PBS、5TIF或 5TIF4，无需任何预处理方案。在某些模型中(图4和 6)，包括腹膜内注射重组IL-4突变蛋白(每公斤体重1mg，每只小鼠约25μg，每周5天，休息2天)，以供比较。
作者测试了5TIF和5TIF4对已确诊哮喘的治疗效果，并与重组IL-4突变蛋白进行了平行比较(图4a,b)。在这些实验中，通过用OVA肽反复刺激8周诱发慢性哮喘，然后用5TIF、5TIF4或IL-4突变蛋白治疗(图4a,b)。根据该方案，5TIF4和5TIF缓解了气道高敏感性，其中5TIF缓解程度较小，而重组IL-4突变蛋白并未起效(图 4c)。FACS分析显示哮喘肺中存在5TIF和5TIF4(图4d,e)。5TIF4比5TIF更能抑制肺部炎症，尤其是PAS染色反映的粘液产生，而重组IL-4突变蛋白对肺部炎症没有任何影响(图4f,g)。此外，5TIF4和5TIF(而非重组IL-4突变蛋白)抑制了嗜酸性粒细胞增多和淋巴细胞浸润到肺部(图4h,i)。5TIF4和5TIF降低了BALF中的IL-5，但5TIF程度较轻，重组IL-4突变蛋白不会降低IL-13；而5TIF4只会降低IL-13，而其他治疗不会降低IL-13(图4j)。这可以通过这些不同治疗对不同来源的IL-5产生影响来解释。同样，虽然重组IL-4突变蛋白和5TIF略微降低了总IgE和IgG1，但没有降低OVA特异性IgE和IgG1，但只有5TIF4能有效抑制这些抗体(图4k)。这些数据表明，只有5TIF4细胞具有抑制肺部已建立的2型炎症的强大能力。
图4.5TIF4细胞对已确诊的 OVA 诱发的2型哮喘的治疗效果
哮喘是一种反复发作的慢性疾病，因此我们通过每周两次鼻腔内OVA刺激和每月一次腹膜内OVA/明矾加强注射(持续6个月)在小鼠中诱发慢性哮喘(图5a)。在此方案下，5TIF和5TIF4均在肺部持续存在并有效抑制肺部炎症，其中5TIF4表现出更强的功效(图5b-g)。在这种慢性和严重哮喘模型中，5TIF最低限度地降低了IL-13和IgE 的产生，而5TIF4仍然有效抑制了这两个因子(图5h,i)。
图5. 5TIF4细胞可长期缓解 OVA 诱发的 2 型哮喘
随后，作者使用了一种更具生理相关性的模型，模拟了屋尘螨(HDM)诱发哮喘的临床情况(图6a)。通过在8周内反复鼻内刺激HDM，然后施用5TIF、5TIF4或IL-4 突变蛋白4周，诱发慢性哮喘(图6a)。在该模型中，5TIF4和程度较小的5TIF减轻了气道过敏，其中5TIF减轻程度较小，重组IL-4突变蛋白无效(图6b)。FACS分析显示肺部存在5TIF和5TIF4(图6c,d)。5TIF4比5TIF更有效地抑制肺部炎症和粘液产生，而重组IL-4突变蛋白对肺部炎症没有任何影响(图6e,f)。类似地，5TIF4和5TIF抑制了嗜酸性粒细胞增多和淋巴细胞浸润到肺部，但重组IL-4突变蛋白没有抑制作用(图6g,h)。BALF中的IL-5被5TIF4降低，被5TIF降低的程度较小，但重组IL-4突变蛋白没有抑制作用，而IL-13仅被5TIF4抑制，其他治疗没有抑制作用(图6i)。同样，只有5TIF4能有效抑制总和HDM特异性IgE和IgG1(图6j)。这些数据表明，在这种更严重的哮喘模型中，只有5TIF4细胞能够强效抑制已建立的2型炎症，这与OVA模型的结果一致(图4)。
图6. 5TIF4细胞对已确诊的 HDM 诱发的 2 型哮喘的治疗效果
作者还测试了5TIF4细胞对HDM诱发哮喘的持久性。在该模型中，小鼠被注入PBS、5TIF或5TIF4细胞，然后休息10周(图7a)。随后，用HDM刺激小鼠诱发哮喘复发(图7a)，类似于季节性过敏性哮喘，定期但不持续地接触过敏原。在该方案下，5TIF和5TIF4细胞均表现出对肺部炎症的抑制，当然，5TIF4表现出更强的功效(图7b-h)。
总之，这些综合数据表明，单次输注5TIF4可长期预防哮喘复发和恶化。
图7. 5TIF4细胞提供长期保护，防止 HDM 诱发的哮喘复发
5.人类5TIF4细胞
最后，作者探索了5TIF4在人T细胞中的诱导作用。在人类5T细胞中编辑了BCOR和ZC3H12A。与野生型人类5T细胞相比，h5TIF4细胞在体内表现出扩增、嗜酸性粒细胞杀伤、持久性和IL-4突变蛋白分泌(图8b-g)。与小鼠类似，h5TIF4细胞共表达PD-1和CD62L(图8h-k)。scRNA-seq分析显示，h5TIF4包含CD4+和 CD8+ T细胞，根据差异基因表达，基于无监督聚类进一步分为九个簇(C0至C8)(图8l-n)。在单细胞水平上，h5TIF4的大部分(包括C0至C5)共表达与干性(SELL、CD27)、耗竭(PDCD1、HAVCR2、LAG3)和功能(IFNG、GZMB和PRF1；图8n)相关的基因，表明h5TIF4具有与CAR19TIF相似的混合特征。在单细胞水平上，h5TIF4中干性和细胞毒性特征共存(图8o,p)，h5TIF4的基因表达模式与CAR19TIF非常相似(图8q)。一小部分h5TIF4细胞(C6)表达与细胞增殖相关的基因，表明大多数h5TIF4细胞在嗜酸性粒细胞耗竭后处于静止状态，如 MKI67、HMGB2和STMN1表达所示(图8l-n)。这些数据表明，h5TIF4细胞可以在NSG小鼠中诱导和维持，从而消除嗜酸性粒细胞并分泌IL-4突变蛋白。
图8. 人类5TIF4细胞的诱导和表征
总结
本研究提供了概念验证和临床前数据，说明通过工程设计的长寿命多功能T细胞能够实现常见慢性疾病哮喘的长期缓解。5TIF4细胞能够稳健地靶向IL-4、IL-5和IL-13，这意味着单次给药就可以长期缓解2型炎症型哮喘的潜在治疗方法。
参考文献
[1] Jin G, Peng M, et al. A single infusion of engineered long-lived and multifunctional T cells confers durable remission of asthma in mice. Nat Immunol. 2024 May 27.
[2] Wang, L. et al. Induction of immortal-like and functional CAR T cells by defined factors. J. Exp. Med. 221, e20232368 (2024).
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